原花青素B2對D-半乳糖模型小鼠腸道菌群的影響

訾雨歌，徐 越，肖 瀛*，吳其國，尹志婷，周一鳴，周小理

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

機體生長發育到成熟階段后，其組織器官和生理功能就會隨年齡的增長出現衰退，機體出現全身性退化性行為的現象稱為衰老[1]。衰老是生命體發展過程的必經階段，不可抗拒，其會從生理和心理多方面降低人的生活質量。當人們進入到衰老期，腸道的屏障、吸收及免疫功能都會發生改變，加上各種外因（飲食習慣改變、疾病藥物的使用、營養攝入平衡等）的影響[2-4]，可導致腸道微生態平衡的破壞。人體腸道微生物基因是最為復雜的，其中棲息著復雜且數量龐大的腸道菌群，細菌的總數比人體細胞總數多10 倍，其種類有100 種以上[5]。菌群影響著營養物質吸收與代謝，在調節人體免疫和預防疾病等方面顯著影響著機體健康[6]。隨著年齡的增長，人體腸道菌群會發生質和量的變化，導致人體菌群出現老化的現象。

原花青素B2作為一種高效的天然抗氧化劑，不僅可以清除體內過多的自由基，還能抑制脂質過氧化的發生，發揮維持體內自由基與抗氧化酶之間穩態的作用，從而預防自由基引起的相關疾病[7]。不可否認的是，原花青素在體內的代謝吸收對其功能的發揮至關重要[8]。原花青素的消化吸收主要發生在小腸部位，但其利用率較低[9]，未吸收的多酚可進入結腸影響腸道菌群結構。原花青素B2影響腸道微生物可能是發揮其功能活性作用的重要途徑之一。因此，本研究采用D-半乳糖誘導衰老模型小鼠，通過Illumina MiSeq高通量測序平臺對小鼠糞便樣本中細菌16S rRNA V4區進行定性分析，解析衰老小鼠腸道菌群的變化，探索原花青素B2抑制小鼠衰老與腸道菌群改變間的關系及可能機理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性4 周齡C 5 7 B L/6小鼠3 0 只，體質量為（15f2）g，購買于上海靈暢生物科技公司（許可證號：SCXK（滬）2013-0018）。將小鼠飼養在室溫為（22f2）℃、12 h晝夜交替的動物房內，自由攝食和飲水，1 周后隨機分為3 組，每組10 只，分2 籠飼養，分別為對照組、衰老組、原花青素B2組。實驗周期為7 周，每天按照0.1 mL/10 g的劑量給衰老組與原花青素組小鼠皮下（頸部）注射質量分數5% D-半乳糖，對照組小鼠注射等劑量的生理鹽水，并根據小鼠體質量的變化調整劑量。對照組與衰老組小鼠飼喂標準飼料AIN93G，原花青素組小鼠飼喂原花青素B2干預飼料（AIN93G＋質量分數0.2%原花青素B2）。

D-半乳糖、肝素鈉（分析純） 上海阿拉丁生化科技公司；原花青素B2（純度≥90%） 上海同田生物技術有限公司；無水乙醇、乙醚（分析純）國藥集團上?；瘜W試劑公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）試劑盒、丙二醛（lipid peroxidation，MDA）試劑盒 南京建成生物研究所；QIAamp DNA Stool Mini Kit 德國Qiagen公司；熒光定量試劑SYBR Premix Ex Taq、DNA純化試劑盒、D2000 DNA Marker 天根生化科技公司。

1.2 儀器與設備

DF-1156型低溫冰箱 日本三洋電機公司；3k-18型離心機 德國Sigma公司；PURELAB Classic型超純水機 英國ELGA公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；TQ8040氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

實驗最后一周早晨，采集小鼠的新鮮糞便約0.1 g于滅菌試管中，－80 ℃凍存待測；另取0.2 g置于滅菌試管中凍存待測。乙醚麻醉后頸椎脫臼法將小鼠處死并迅速打開腹腔，取出十二指腸和結腸，在冰浴條件下用生理鹽水勻漿，制成質量分數10%組織勻漿液，4 ℃、5 000 r/min離心10 min取上清液，保存于－80 ℃待測。

1.3.2 抗氧化指標測定

取1.3.1節勻漿好的上清液，按照試劑盒說明書測定T-AOC、SOD及CAT活力和MDA含量。

1.3.3 糞便DNA提取及測序

稱取200 mg糞便于2 mL離心管中，按試劑盒說明書提取DNA，將DNA樣品送至上海美吉生物科技公司進行16S rDNA測序。

1.3.4 SCFAs含量測定

稱取0.1 g糞便樣品置于2 mL離心管中，加入500 μL飽和NaCl溶液，打碎均質至無明顯塊狀物后加入20 μL硫酸溶液（由0.5 mL濃硫酸和5 mL水混合配制）酸化，漩渦振蕩30 s，加入800 μL無水乙醚以萃取短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）。將溶液漩渦振蕩30 s，14 000 r/min離心15 min后吸取上清液，將上清液加到裝有0.25 g無水硫酸鈉的2 mL離心管中，再次以同樣條件離心，以除去上清液中殘留的水分，轉入GC樣品瓶。

GC條件：載氣為He；分流比為10∶1；流速為2.0 mL/min；升溫程序為7.5 ℃/min從100 ℃上升至140 ℃，保持4 min；60 ℃/min升溫至200 ℃。柱箱溫度100 ℃，進樣口溫度240 ℃，離子源溫度220 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延遲時間0.5 min。MS采集時間1.5～9.5 min，采集方式為Q3 Scan，m/z范圍是20.00～300.00，進樣量為1 μL，每個樣品檢測時間均為23.58 min。

1.4 數據統計與分析

數據采用fs表示，并采用SPSS 11.5軟件中的方差分析方法進行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。對Illumina MiSeq測序的質量進行質控和過濾，區分樣本后進行運算分類單位（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析和物種分類學分析，基于OTU對測序進行多種多樣性指數分析以及深度檢測；基于分類學信息在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。在上述分析的基礎上，對多樣本的群落組成和系統發育信息進行多元分析和差異顯著性檢驗等一系列深入的統計學和可視化分析。

2 結果與分析

2.1 原花青素B2對小鼠體質量及抗氧化指標的影響

在一定程度上，小鼠體質量變化能反映小鼠的生長發育情況[10]。如圖1所示，前3 周小鼠體質量增長較快，從第4周開始小鼠體質量增長的速度下降；與對照組小鼠比較，衰老組小鼠體質量有所減輕，原花青素B2組小鼠體質量有所增大，這表明D-半乳糖抑制了小鼠正常生長，原花青素B2對D-半乳糖造成衰老小鼠體質量降低有所改善。

圖1 原花青素B2對小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of procyanidin B2 on body mass in aging mice

表1 原花青素B2對衰老小鼠抗氧化指標的影響Table1 Effect of procyanidin B2 on antioxidant indices of aging mice

從表1可知，與對照組比較，衰老小鼠的十二指腸中SOD、CAT活力和T-AOC與對照組沒有顯著差異，但均有下降趨勢；結腸中T-AOC和SOD活力同樣與對照組差異不顯著，但CAT活力顯著下降。衰老小鼠十二指腸與結腸組織的MDA含量均顯著上升（P＜0.05）。與衰老組比較，原花青素組小鼠十二指腸中T-AOC、SOD和CAT活力都顯著升高（P＜0.05）；在結腸組織中SOD和CAT活力顯著上升（P＜0.05），但T-AOC差異不顯著。這表明原花青素B2可以提高衰老小鼠十二指腸和結腸組織的抗氧化能力，清除體內過多的自由基，抑制脂質過氧化，降低MDA 含量。

2.2 原花青素B2對小鼠腸道菌群多樣性的影響

圖2 小鼠腸道微生物多樣性指數Fig.2 Diversity index of gut microf l ora in mice

為探究3 組小鼠腸道菌群之間的相關性，本研究采用RDP classif i er貝葉斯算法計算在97%相似水平的OTU數量，發現對照組的OTU數量為229 個，衰老組的OTU數量為233 個，原花青素的OTU數量為230 個。3 組共有的OTU數為212 個，對照組與衰老組共有但原花青素B2組沒有的OTU數量是5 個，衰老組與原花青素B2組共有但對照組沒有的OTU數量是11 個。如圖2所示，衰老組的Alpha多樣性Shannon指數極顯著高于原花青素B2組（P＜0.01）。

圖3 小鼠腸道微生物多樣性的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the diversity of gut microf l ora in mice

如圖3所示，基于OTU水平利用主成分分析進行分類。衰老組樣本與對照組樣本相距較遠，表明D-半乳糖對小鼠腸道菌群組成及結構影響較明顯。原花青素B2組與對照組相距較近，表明原花青素B2干預的小鼠腸道菌群結構與對照組相似。

圖4 小鼠腸道菌群門水平相對豐度Fig.4 Abundance of dominant intestinal bacterial phyla in mice

如圖4所示，對照組、衰老組、原花青素B2組小鼠的腸道菌群門水平都以Bacteroidetes和Firmicutes為主，其相對豐度分別為63.78%和22.67%、44.19%和44.81%、60.34%和33.96%。

如圖5所示，3 組小鼠的腸道菌群屬水平組成如下：對照組小鼠的糞便中包含norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus等多個屬，還有11.22%的其他菌屬。衰老組小鼠的糞便中主要包含norank-f-Bacteroidales-s24-7、Ruminiclostriduim、Bacteroides、Bifidobacterium、Blautia、unclassified-Lachnospiraeae等菌屬。原花青素B2組樣品主要包括norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bacteroides、Bif i dobacterium、Blautia、unclassif i ed-Lachnospiraeae等菌屬。

圖5 小鼠腸道菌群屬水平相對豐度Fig.5 Abundance of dominant intestinal bacterial genus in mice

2.3 原花青素B2對小鼠腸道差異菌群的影響

圖6 原花青素B2對小鼠腸道B/F值的影響Fig.6 Effect of procyanidins B2 on B/F ratio in mice

如圖6所示，在門水平上，與對照組相比，衰老組小鼠的B/F值（擬桿菌門與厚壁桿菌門數量比值）顯著降低。與衰老組相比，原花青素B2組的B/F值顯著上升。進一步比較3 組小鼠腸道菌群的差異性，分析差異性菌屬，如圖7所示，發現7 種存在顯著差異的菌屬：norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bacteroides、Blautia、unclassified-Lachnospiraeae、Ruminiclostridium、Lachnospiraeae-NK4A136、Roseburia。相比于對照組，衰老組小鼠norank-f-Bacteroidales-s24-7的相對豐度顯著降低，而其他菌屬的相對豐度顯著上升。與衰老組相比，原花青素B2組小鼠中norank-f-Bacteroidales-s24-7、Roseburia、Lachnospiraeae-NK4A136和Bacteroides菌屬的相對豐度顯著上升，而Blautia、unclassified-Lachnospiraeae和Ruminiclostridium的相對豐度顯著降低。

圖7 小鼠腸道微生物差異性菌屬Fig.7 Differential genus of gut microf l ora in mice

2.4 原花青素B2對小鼠糞便中SCFAs含量的影響

表2 原花青素B2對小鼠糞便中SCFAs含量的影響Table2 Effect of procyanidin B2 on SCFAs contents in feces of mice

如表2所示，衰老組乙酸、丙酸、丁酸、總酸的含量均顯著低于對照組（P＜0.05），在經過原花青素B2干預后，小鼠糞便中各SCFAs含量顯著高于對照組與衰老組，這表明原花青素B2可調節產SCFAs菌群的豐度。

3 討 論

本研究發現原花青素干預的衰老模型小鼠腸道的T-AOC和SOD、CAT活力都顯著增加。當機體發生衰老時，體內自由基動態平衡失衡，會發生如脂質過氧化、蛋白質氧化、DNA突變等現象，從而產生氧化應激，導致相關疾病的發生[11-13]。原花青素B2具有多個酚羥基，能有效地清除衰老小鼠體內過多的超氧自由基、過氧化氫及過氧化物，抑制脂質過氧化產物堆積，從而延緩機體衰老進程。

腸道菌群是由種類繁多的大量微生物組成的龐大復雜的生態系統，與宿主的生長、發育、物質代謝和衰老有著密切的關系[14]。但如果機體內的自由基動態平衡失調，過量的自由基會引起腸黏膜損傷，使機體遭受致病菌侵染[15-16]。本研究發現飼喂原花青素飼料后，小鼠腸道優勢菌群為Bacteroidetes和Firmicutes這兩個細菌門，同時B/F值也顯著上升，與Bezirtzoglou等[17]的研究結果一致。Bacteroidetes可以分解植物中的糖類物質，使其轉化為對身體有益的產物[18-19]。同時，在原花青素干預后，衰老小鼠體內Bacteroides的相對豐度顯著提高，與對照組沒有顯著差異，這與Ley等[20-21]的研究結果一致，表明原花青素B2可調節衰老小鼠腸道中Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度，調整腸道菌群結構，從而延緩衰老進程。

本研究發現原花青素B2干預的衰老模型小鼠Roseburia和Lachnospiracea屬的相對豐度均顯著上升，其中Roseburia是一類在結腸代謝產生丁酸的革蘭氏陽性菌，其可以發酵葡萄糖產生乳酸及少量乙酸[22]。據報道，身體虛弱的老年人[23]、結直腸癌患者[24]以及肝硬化患者[25]的糞便中丁酸鹽產生菌顯著減少。王芳[25]通過Illumina MiSeq測序分析發現百歲老人腸道中球狀梭菌類群的Roseburia屬相對豐度顯著增加，Zhao Liang等[26]也得到同樣的結果。unclassif i ed-Lachnospiraeae是厚壁菌門中產生丁酸鹽的重要類群，丁酸被證實能夠減輕腸炎對黏膜的損傷[27]，并且能夠緩解衰老導致的腸道炎癥[28-30]。原花青素B2干預后，衰老小鼠體內SCFAs含量顯著上升。SCFAs尤其是丁酸能通過影響白細胞黏附分子的表達而起到抗炎作用，同時，SCFAs可保護黏膜細胞的正常功能，減少有毒物質的吸收，增加細胞活性，延緩衰老[31-33]。原花青素可促進小鼠腸道代謝產生SCFAs，調節腸道pH值，維持腸道內環境穩定，進而改善衰老機體腸道菌群的平衡狀態，具有延緩衰老的作用。

本研究結果表明原花青素B2可以增強衰老小鼠腸道抗氧化活性，調節腸道菌群結構，一定程度上增加了產生丁酸類有益菌的相對豐度，促進SCFAs產生，維持腸道平衡，進而延緩衰老進程。