利用下一代測序進行的羅氏易位攜帶者1例遺傳學診斷

鄧 慶，馬 健

(1.錦江生殖成都西囡婦科醫院檢驗科,四川成都 610000；2.四川錦欣婦女兒童醫院檢驗科,成都 610000)

羅氏易位指2個近端著絲粒染色體在著絲處或其附近斷裂后融合成為1個染色體，導致染色體數減少，長臂數不變，短臂數減少2條的現象。羅氏易位發生在5條近端著絲粒染色體(13、14、15、21、22號染色體)上，羅氏易位攜帶者只有45條染色體，缺少1條染色體[1]。其人群攜帶率為1.23/1 000，占不孕人群的2%～3%[2]。

一般而言，發生羅氏易位的5條染色體短臂的丟失不會對個體發育產生嚴重影響。雖然表型正常，由于在第1次減數分裂過程中羅氏易位攜帶者生殖細胞易位染色體和相應2個正常染色體配對會形成3價染色體，這種結構會導致交替、鄰式和不常見3∶0 3種分裂方式的出現[3]。只有交替可產生正?；蚱胶獾呐渥樱渌?種方式產生非平衡的配子，一旦羅氏易位攜帶者與健康者婚配，這種占大部分的非平衡配子可能會導致易位攜帶者出現妊娠困難或妊娠過程中反復流產，甚至會導致21-三體綜合征、13-三體綜合征等先天缺陷患兒的出生[4]。

羅氏易位是導致不孕及妊娠質量不高的一種家族遺傳性疾病[5]。本研究選取一對有過胚胎停育和自然流產史、女方屬高齡產婦、男方攜帶羅氏易位衍生染色體的夫婦，通過對其體外受精得到的胚胎進行胚胎植入前遺傳學檢測，通過一定的分析方法進行比對驗證從而挑選出正常合適的胚胎進行移植，可避免臨床上羅氏易位攜帶者異常胚胎植入后的選擇性終止妊娠，大幅度降低了婦女身心痛苦和妊娠失敗風險，阻斷羅氏易位疾病的垂直傳播[6]；減輕社會和家庭負擔。

1 資料與方法

1.1樣本來源 女方37歲，1次胚胎停育，3次自然流產。男女雙方染色體核型分析：女方核型正常，男方羅氏易位攜帶45，XY，-13,-14，+Rob(13∶14)。申請胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)技術助孕，采用促排卵方案后采卵1次，體外受精得到囊胚4枚，通過胚胎活檢對4個囊胚期滋養外胚層細胞進行采樣同時采取夫妻雙方外周血基因組樣本，通過達瑞生殖PGS檢測篩查出染色體不平衡胚胎，并經倫理學審查和達瑞生殖技術性手段胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)來檢測與構建受檢胚胎的單體型。

1.2儀器及耗材 REPLI-g?single Cell Kit(24)購自QIAGEN企業管理(上海)有限公司，Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0購自美國life公司，Agencourt AMPure XP購自美國BECKMAN公司，QubitTMdsDNA HS Assay Kit購自美國Life公司，KAPA SYBR?FAST Universal qPCR Kit購自美國KAPA公司，PCR擴增反應試劑購自日本TaKaRa，所有引物合成自美國invitrogen公司，測序試劑均購自美國life公司。Qubit?3.0 Fluorometer熒光計購自美國Life公司，定性PCR儀(ABI3130)、實時熒光定量PCR儀(ABI7500)均購自美國ABI公司，DA8600半導體測序儀購自美國Life公司。

1.3方法

1.3.1單細胞全基因組擴增 基于準隨機引物線性擴增的原理并根據單細胞全基因組擴增試劑盒(REPLI-g?single Cell Kit)說明書對每個囊胚期滋養層細胞進行細胞裂解、預擴增、指數擴增和擴增產物純化，產物濃度稀釋10倍后經熒光定量儀(Qubit 3.0)測濃度。

1.3.2文庫構建 100 ng DNA經文庫構建試劑盒(Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0)構建文庫DNA。PCR特異性擴增目的片段，在DNA片段兩端加上通用測序接頭，PCR擴增文庫DNA，磁珠純化去除雜質；文庫構建后Qubit 3.0測濃度。多重PCR所需引物250對均用Ampliseq網站設計，由invitrogen公司合成。

1.3.3高通量測序文庫qPCR定量 根據Qubit 3.0測定的濃度結果，取2 μL文庫樣品稀釋至200 pM。根據實時定量PCR試劑盒(KAPA SYBR?FAST Universal qPCR Kit)配制反應總體系。稀釋后的文庫樣品和標準品各取4 μL進行定量。反應結束后根據循環數計算每個文庫樣本的實際濃度。

1.3.4上機模板制備與測序 根據每個樣本測序數據量和測序深度確定文庫的混樣個數進行模板制備，使用模板制備試劑盒(Ion PGMTM Template OT2 200 kit)制備測序模板；然后進行陽性模板的富集即去除雜質及擴增失敗的測序模板；最后使用高通量測序試劑盒(Ion PGMTM Sequencing 200 kit v2)在 PGMTM測序平臺上進行測序。

1.4數據處理 數據下機后進行生物信息分析。首先對下機的原始數據進行測序質量評估，去除接頭序列，通過Torrent Mapping Alignment Program軟件比對到人類基因組參考序列hg19上，通過samtools統計覆蓋倍數，通過GATK calling SNP基因型分析，最后結合家系進行SNP連鎖分析，對患者樣本13、14號染色體進行單體型構建，進行結果判定。

2 結 果

2.1胚胎測序結果分析 下一代測序(NGS)檢測結果匯總見表1。F為父親樣本，M為母親樣本，F1、F2為父親樣本13號染色體的2條染色體單體(其中F1為父親攜帶的13號與14號發生了羅氏易位的衍生染色體)，M1、M2為母親樣本13號染色體的2條染色體單體。1號胚胎7號染色體有26.12 Mb的缺失且遺傳了父親的羅氏易位衍生染色體為羅氏易位攜帶胚胎；2號胚胎14號染色體有82.99 Mb的缺失且為染色體不平衡胚胎；3號胚胎染色體數目正常且沒有遺傳到父親的羅氏易位衍生染色體，為正常胚胎；4號胚胎染色體數目正常且遺傳了父親樣本的羅氏易位衍生染色體，為羅氏易位攜帶胚胎。

2.213、14號染色體單體型構建結果 父、母親與4個受檢胚胎13、14號染色體單體型構建的結果見表2、3。遺傳了羅氏易位衍生染色體F1的1號胚胎13號染色體上20個SNP位點與14號染色體上28個SNP位點信息與父親樣本的F1染色體相同；而同樣遺傳了羅氏易位衍生染色體F1的4號胚胎13號染色體上20個SNP位點與14號染色體上27個SNP位點信息與父親樣本的F1染色體相同；說明1、4號胚胎的羅氏易位衍生染色體確實來源于父親。2號胚胎14號染色體只有1條染色單體，為染色體缺失；3號胚胎13號與14號染色體則遺傳了父母雙方的正常染色單體。

表1 4個胚胎的NGS結果匯總

表2 13號染色體單體型構建結果

續表2 13號染色體單體型構建結果

注：S17081801-F表示父親樣本；S17081801-M表示母親樣本；S17081801-1表示1號受檢胚胎；S17081801-2表示2號受檢胚胎；S17081801-3表示3號受檢胚胎；S17081801-4表示4號受檢胚胎；SNP_1～SNP_20表示受檢樣本13號染色體上的1號SNP位點到20號SNP位點；“：”和“|”分別表示父母樣本和子代樣本同一條染色體相鄰2個SNP的分隔符，均起到區分作用；“？”表示未知的結果或者是檢測到SND但無法確定

表3 14號染色體單體型構建結

注：S17081801-F表示父親樣本；S17081801-M表示母親樣本；S17081801-1表示1號受檢胚胎；S17081801-2表示2號受檢胚胎；S17081801-3表示3號受檢胚胎；S17081801-4表示4號受檢胚胎；SNP_1～SNP_20表示受檢樣本14號染色體上的1號SNP位點到20號SNP位點；“：”和“|”分別表示父母樣本和子代樣本同一條染色體相鄰兩個SNP的分隔符，均起到區分作用；“？”表示未知的結果或者是檢測到SND但無法確定

3 討 論

胚胎植入前遺傳學檢測是在體外受精-胚胎移植基礎上對卵母細胞或種植前胚胎進行活檢，利用分子生物學手段進行檢測，選擇正常或遺傳表型正常的胚胎移植，從而有效降低流產率，提高活產率，避免選擇性終止妊娠。

胚胎植入前遺傳學檢測主要包括PGS和PGD 2個方面，PGS是對胚胎23對染色體非整倍體異常、微缺失、微重復異常進行篩查，選擇沒有發生染色體數目和結構異常的胚胎進行移植，有效降低早期流產風險，顯著提高臨床妊娠率。PGD是針對不同的病因在胚胎著床之前即對配子或胚胎進行遺傳物質分析，選擇沒有發生染色體數目和結構異常的胚胎進行移植，可有效阻斷家族遺傳病的垂直遺傳。

對染色體羅氏易位攜帶者進行PGD檢測，目前已被報道的檢測技術主要包括熒光原位雜交技術(FISH)、微陣列比較基因組雜交(aCGH)及NGS，這些檢測技術均在對染色體易位的檢測中發揮了重要作用，各有優勢，同時，也均具有一定的局限性。

FISH技術曾是PGD主要的遺傳學方法之一，用以篩查染色體臂間倒位及易位，判定是否存在嵌合以及染色體異常[7]。其局限性主要表現在由于探針數量或染料種類的限制，FISH技術無法全面檢測23對染色體[8]；2012、2013年波蘭學者LUKASZUK博士分別利用FISH技術和NGS作為技術手段對一對男方攜帶有14、15號染色體羅氏易位衍生染色體的夫婦進行PGD檢測輔助生殖，2012年1月進行FISH檢測挑選后移植，但由于FISH技術無法對染色體數目進行全面篩查，所植入胚胎在第10個孕周時流產；2013年9月該團隊取樣10枚囊胚期胚胎細胞，采用與本研究同樣的NGS檢測技術，經全基因組擴增利用Ion PGM測序儀及其配套NGS試劑進行測序，根據分析結果挑選1枚健康胚胎移植，成功輔助夫婦誕下一名健康嬰兒[9]。說明了NGS技術可實現檢測胚胎是否攜帶羅氏易位衍生染色體的同時還對染色體是否發生了非整倍體數目異常進行檢測，首先排除會造成流產或先天性出生缺陷的染色體數目異常胚胎，實現更加全面的遺傳學檢測。

aCGH技術是與FISH相關、能篩查出胚胎染色體數目異常的檢測技術，但aCGH與本研究中應用的NGS在篩查染色體數目異常的準確率方面存在差異，2015年YANG等[10]采用NGS技術進行了79例植入前遺傳學檢測，采用aCGH進行了78例植入前遺傳學檢測，采用NGS檢測的流產率為1.3%，采用aCGH檢測的流產率為2.6%；2016年NISSON等[11]將NGS和aCGH進行了對比研究，結果顯示，NGS準確率為95%，aCGH準確率為87%。故相對于FISH，本研究采用的達瑞生殖基于Ion PGM測序儀在胚胎活檢后進行NGS的檢測方法在羅氏易位攜帶者檢測方面在實現更加全面的檢測同時在染色體數目異常檢測的準確率方面優于aCGH技術，且通過一個配套的實驗流程，使用同一套儀器設備能同時達到染色體數目篩查和羅氏易位衍生染色體檢測的目的，讓PGD檢測更加全面、精確和便捷。

作為新型羅氏易位攜帶者PGD檢測技術，NGS本身也具有一定的局限性，如因單細胞全基因組擴增(WGA)過程中可能存在的等位基因脫扣有可能造成誤診或漏診[12]。而本研究在NGS的數據分析中結合了核型分析的結果在13號染色體區域選了20個SNP位點、14號染色體區域上選取了28個SNP位點進行家系單體型構建，再通過SNP連鎖分析構建4號受檢胚胎13、14號染色體的單體型，有效避免了等位基因脫扣對檢測結果判讀的影響；而在2017年XU等[13]采用同樣基于NGS檢測技術的等位基因映射識別攜帶者單體型技術對3對羅氏易位攜帶者夫婦的12例胚胎先后進行羅氏易位攜帶者PGD檢測與分析，對特定區域選取了6個SNP位點進行連鎖分析來構建單體型，其中2對夫婦各獲得1個健康胚胎，進行植入后其中一對夫婦已成功誕下健康嬰兒，另一對夫婦成功得到妊娠，羊水穿刺顯示核型分析正常。與2017年XU等[13]研究結果比較，本研究在特定區域選取了更多的SNP位點進行連鎖分析，能更好地避免等位基因脫扣造成誤診的問題，令胚胎染色體單體型構建可信度更高。

本研究采用WGA結合NGS和SNP連鎖分析，通過單體型的構建可推斷胚胎2條DNA鏈的來源，從而最終確定其是否為正常胚胎。根據本研究4個胚胎的檢測結果，1、2號胚胎均存在染色體異常，經構建13、14號染色體單體型，進一步進行PGD檢測，鑒定1、4號胚胎均為羅氏易位攜帶者。由于羅氏易位衍生染色體攜帶者在表型上和正常核型的人并無差異[14]，往往因為其子女患有某種疾病而確診[15]，沒有發生染色體數目變異的3、4號胚胎均為可正常出生和發育成長的可移植胚胎；但羅氏易位攜帶者在生育時存在較高風險生出染色體異常的后代，3號胚胎由于沒有攜帶羅氏易位衍生染色體，故為優質胚胎。最后選擇核型正常且沒有致病基因攜帶的3號胚胎進行植入，阻斷了羅氏易位衍生染色體的垂直遺傳，有利于優生優育。

目前，國內外均可見到NGS用于PGS/PGD的文獻報道，但由于當下PGS、PGD需對胚胎細胞進行活檢取樣，這個過程對胚胎本身的損傷也備受爭議。近年來，對PGS和PGD的部分文獻還報道了其存在子代安全性[16]及后天發育的問題[17]，但目前缺乏這方面的樣本積累及研究。近年來，無創胚胎染色體篩查技術已興起，該技術應用游離在胚胎培養液中的微量DNA通過單細胞全基因擴增技術實現對胚胎染色體的全面篩查[18]，將從胚胎上提取細胞的活檢形式改成從培養液中提取DNA，保留了胚胎樣本的完整性。相信隨著科技的進步，PGS和PGD會用于各種生殖遺傳疾病方面的檢測，對羅氏易位攜帶者的PGD技術會越來越成熟和可靠。