雙龍方對(duì)離體大鼠冠狀動(dòng)脈舒縮功能的影響及機(jī)制*

余丞浩，王建農(nóng)，張金艷

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091）

雙龍方是李連達(dá)院士在治療心血管疾病方面的臨床經(jīng)驗(yàn)方，是根據(jù)益氣活血化瘀原理，以具有益氣功效的人參配伍活血化瘀功效的丹參組方的中藥復(fù)方制劑，具有益氣養(yǎng)血、活血通脈的功效，用于氣虛血瘀（本虛標(biāo)實(shí)）之胸痹證，適用于心血管突發(fā)性疾病，療效顯著。本研究的前期研究中分別建立了犬[1]、小型豬[2]、大鼠[3]心肌梗死模型，結(jié)果表明，雙龍方對(duì)以上冠狀動(dòng)脈結(jié)扎所致心肌梗死模型均有明顯治療作用。進(jìn)一步觀(guān)察了雙龍方對(duì)犬血流動(dòng)力學(xué)的影響，主要有減慢心率，降低心肌耗氧、增加冠狀動(dòng)脈血流量等作用[4]，其作用機(jī)制尚不明確。近期的試驗(yàn)結(jié)果顯示，雙龍方可有效防治心肌缺血-再灌注后的無(wú)復(fù)流現(xiàn)象[5]，并有顯著擴(kuò)張大鼠腸系膜動(dòng)脈的作用，該作用與抑制電壓依賴(lài)型鈣離子通道功能及5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NA）受體功能有關(guān)[6]。但冠狀動(dòng)脈形成起源、生物學(xué)特點(diǎn)及藥理學(xué)特點(diǎn)均不同于其他血管[7-8]，本研究中擬進(jìn)一步研究其對(duì)大鼠離體冠狀動(dòng)脈舒縮功能的影響，進(jìn)而闡述雙龍方對(duì)心血管活性作用的機(jī)制，為雙龍方治療心血管疾病提供試驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物、試藥與儀器

動(dòng)物：清潔級(jí)，6～7周齡雄性，SD大鼠20只，體質(zhì)量220～300 g，由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0002。

試藥：氯化鉀（KCl，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20170526）；5-HT（Sigma公司，批號(hào)為SLBP9361V）；血栓素A2受體激動(dòng)劑（U46619，Chem Cruz公司，批號(hào)為G2717）；雙龍方由人參提取顆粒（2．5 g生藥／g）與丹參提取顆粒（10 g生藥／g）按人參、丹參生藥比例7∶3配制，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院提供。藥品和試劑均于臨用前以0．9%氯化鈉溶液配置。

儀器：DMT620型多腔離體微血管金屬絲肌動(dòng)描記儀（ADInstruments Co．，Australia）；精密pH計(jì)（Mettler-Toledo Instruments Co．，Shanghai）；連續(xù)變倍體視顯微鏡（Nikon Instruments Co．，Shanghai）。

1．2 方法

離體動(dòng)脈環(huán)制備：頸椎脫臼處死大鼠，分離冠狀動(dòng)脈，放入冷的Krebs液（由氯化鈉119 mmol／L，氯化鉀4．6 mmol／L，氯化鈣1．5 mmol／L，磷酸二氫鈉1．2 mmol／L，氯化鎂1．2 mmol／L，碳酸氫鈉15 mmol／L，葡萄糖5．6 mmol／L[9]組成），顯微鏡下繼續(xù)分離冠狀動(dòng)脈，去除周?chē)じ浇M織。將處理好的動(dòng)脈剪為1．5 mm長(zhǎng)的圓筒段，即冠狀動(dòng)脈環(huán)，4℃保存，備用。

標(biāo)本掛置及血管活性篩選：顯微鏡下，以2根25μm的鎢絲穿入冠狀動(dòng)脈環(huán)內(nèi)腔，分別以螺絲將2根鎢絲的兩端固定于肌動(dòng)描記儀的器官浴槽中。浴槽內(nèi)盛37℃、pH 7．4的Krebs液，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體[10]。調(diào)節(jié)動(dòng)脈環(huán)基礎(chǔ)張力至1．5 mN，平衡1．5 h。

藥物濃度設(shè)置：將雙龍方顆粒用0．9%氯化鈉溶液溶解，配置成所需質(zhì)量濃度。除研究低、中、高質(zhì)量濃度（相當(dāng)于每1 L中含8，16，32 g生藥）雙龍方對(duì)血管的直接擴(kuò)張作用外，根據(jù)直接舒張作用研究中的結(jié)果，考慮機(jī)制研究中需要降低雙龍方溫育時(shí)對(duì)血管環(huán)平衡后基礎(chǔ)張力的影響，以防干擾對(duì)機(jī)制的研究，故選取效應(yīng)研究中藥物起效濃度的低濃度組，作為該機(jī)制研究中的高濃度組。

對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈的直接舒張作用：分別用10-5mol／L的5-HT和5×10-7mol／L的U46619收縮血管，張力穩(wěn)定后，將低、中、高質(zhì)量濃度（每1 L含8，16，32 g生藥，設(shè)為Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組）的雙龍方加入器官浴槽，其中空白對(duì)照組（Ⅰ組）加等量0．9%氯化鈉溶液，考察其對(duì)冠狀動(dòng)脈的直接舒張作用。舒張率分別以相對(duì)于10-5mol／L 5-HT和5×10-7mol／L U46619預(yù)收縮高度的百分比表示。

對(duì)電壓依賴(lài)型鈣離子通道功能的影響：檢驗(yàn)血管活性良好、張力穩(wěn)定后，將低、中、高質(zhì)量濃度（每1 L含2，4，8 g生藥，設(shè)為B，C，D組）的雙龍方加入器官浴槽溫育5 min，空白對(duì)照組（A組）加等量0．9%氯化鈉溶液，各組按累加濃度法加入KCl，記錄血管對(duì)KCl收縮的量-效曲線(xiàn)，分別計(jì)算最大收縮（Emax）及產(chǎn)生最大效應(yīng)1／2時(shí)所需藥物的負(fù)對(duì)數(shù)（pEC50）。

表1 不同質(zhì)量濃度雙龍方對(duì)預(yù)收縮大鼠冠狀動(dòng)脈的舒張作用比較（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=8）

對(duì)受體依賴(lài)型鈣離子通道功能的影響：檢驗(yàn)血管活性良好、張力穩(wěn)定后，將低、中、高質(zhì)量濃度（每1 L含2，4，8 g生藥，設(shè)為B，C，D組）的雙龍方加入器官浴槽溫育5 min，空白對(duì)照組（A組）加等量0．9%氯化鈉溶液，各組分別按累加濃度法加入血管收縮性G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑（5-HT，U46619），分別計(jì)算其Emax及pEC50。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。組間數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)；方差不齊用Tamhane′s T2檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈的舒張作用

結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。雙龍方各組舒張率與Ⅰ組比較，均有顯著性差異（P＜0．01）。

圖1 雙龍方對(duì)預(yù)收縮大鼠冠狀動(dòng)脈的舒張作用（n=8）

2．2 對(duì)電壓依賴(lài)型鈣離子通道功能的影響

結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。與A組比較，D組KCl最大收縮達(dá)5-HTEmax顯著降低（P＜0．05）；各組間pEC50無(wú)顯著差異。

表2 不同濃度雙龍方對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈KCl量-效曲線(xiàn)的影響（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=8）

圖2 雙龍方對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈KCl量效曲線(xiàn)的影響（n=8）

2．3 對(duì)受體依賴(lài)型鈣離子通道功能的影響

結(jié)果見(jiàn)圖3和表3、表4。與A組比較，B，C，D組5-HT的Emax均顯著降低（P＜0．01），各組間pEC50無(wú)顯著差異；與A組比較，C組、D組U46619的Emax均顯著降低（P＜0．01），各組間pEC50無(wú)顯著差異。

3 討論

圖3 雙龍方對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈量效曲線(xiàn)的影響（n=8）

表3 不同質(zhì)量濃度雙龍方對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈5-HT量-效曲線(xiàn)的影響（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=8）

表4 不同質(zhì)量濃度雙龍方對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈U46619量-效曲線(xiàn)的影響（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=8）

通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)，以詞頻“大鼠”并含“冠狀動(dòng)脈”并含“收縮”或“舒張”為主題詞檢索1979年至2018年微血管文獻(xiàn)，共檢索到文獻(xiàn)111篇，通過(guò)逐一閱讀文獻(xiàn)摘要排除81篇，保留相關(guān)度高的共30篇，其中1991年1篇，1996年1篇，2011年1篇，2013年至2015年12篇，2016年至2018年15篇?？梢?jiàn)，隨著儀器設(shè)備的應(yīng)用開(kāi)發(fā)與分離技術(shù)的提高，大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)張力測(cè)定試驗(yàn)應(yīng)用在心血管藥物的研究方面正逐漸興起。

大鼠的微血管尤其是冠狀動(dòng)脈因其壁薄腔小，難以從組織完整分離而不損傷平滑肌，穿金屬絲行張力測(cè)定時(shí)又極易損傷血管內(nèi)皮，因此分離大鼠冠狀動(dòng)脈行張力測(cè)定的操作難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大鼠的大血管及大型動(dòng)物（豬、犬、兔等）的微血管。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[5]和實(shí)際操作，整理和總結(jié)分離大鼠冠狀動(dòng)脈時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)：避免麻醉藥對(duì)某些血管平滑肌的功能造成影響，進(jìn)行血管張力測(cè)定試驗(yàn)的大、小鼠應(yīng)盡量采用頸椎脫臼處死法；應(yīng)迅速盡可能排空離體心臟里殘留淤血，固定在黑色背景襯托的培養(yǎng)皿內(nèi)，便于血管的觀(guān)察與分離；盡量降低組織代謝，保持血管良好的活性，血管的分離過(guò)程宜在冰浴下進(jìn)行，同時(shí)，整個(gè)分離過(guò)程宜敏捷而迅速，如單人操作制備4個(gè)血管環(huán)樣本宜控制在40 min以?xún)?nèi)完成；游離血管時(shí)不要鉗夾、牽拉血管，以免損傷平滑肌，外周的脂肪組織要盡可能地去除干凈；裁取金屬絲兩端宜使用銳利的器械（如手術(shù)剪）剪去，避免金屬絲兩端曲折變形或有鈍芒，進(jìn)而減少穿越阻力和防止刺傷血管；穿血管的金屬絲端應(yīng)一直保持筆直狀態(tài)，避免中途折曲而損傷血管內(nèi)皮，在穿金屬絲時(shí)手要穩(wěn)，盡量在血管腔中間一次性穿過(guò)，避免鋼絲反復(fù)摩擦到管壁平滑??；張力測(cè)定全程通以混合氣，氣流的速度應(yīng)控制好（以3～5個(gè)氣泡／秒為宜）；掛置完血管環(huán)后，設(shè)置好與血管環(huán)相匹配的、適宜的標(biāo)準(zhǔn)化初始張力，然后再正式進(jìn)行試驗(yàn)。由此可知，操作中保持血管平滑肌的完整性與良好活性是血管張力測(cè)定試驗(yàn)得以進(jìn)行的前提。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)分離大鼠冠狀動(dòng)脈試驗(yàn)技術(shù)的掌握，為本項(xiàng)研究提供了技術(shù)保障。

血管收縮功能的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是血管平滑肌，血管平滑肌細(xì)胞上L型鈣離子通道對(duì)血管張力的調(diào)節(jié)起重要作用[11]。根據(jù)其調(diào)控通道開(kāi)閉機(jī)制的不同，平滑肌細(xì)胞膜上的鈣離子通道主要可分為電壓依賴(lài)型和受體依賴(lài)型。電壓依賴(lài)型鈣離子通道（VDCC）隨著細(xì)胞膜去極化而開(kāi)放，與膜電壓變化相關(guān)；受體依賴(lài)性鈣離子通道（RDCC）主要通過(guò)平滑肌細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，誘導(dǎo)其開(kāi)放[6]。平滑肌的收縮調(diào)節(jié)主要通過(guò)電壓依賴(lài)性鈣離子通道的調(diào)控[12]。

血栓素A2（TXA2）、5-HT是常見(jiàn)的2種血管舒縮性介質(zhì)。TXA2主要由血小板中的前列腺素H2在TXA2合酶作用下生成，有促進(jìn)血小板聚集和收縮血管平滑肌作用，參與多種心血管疾病及腎臟疾病的發(fā)生[13]。TXA2收縮血管平滑肌的作用機(jī)制為激活環(huán)核苷酸門(mén)控通道引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加[14]及激活TXA2受體和磷脂酶C（PLC）[15]。

5-HT又名血清素，為常見(jiàn)的神經(jīng)遞質(zhì)及血管收縮劑，其受體主要有5-HT1R，5-HTZR，5-HT3R，5-HT4R，5-HT5R，5-HT6R和5-HT7R 7種類(lèi)型和14種亞型[16-17]。除5-HT3R屬配體門(mén)控通道外，其余6種均為G蛋白偶聯(lián)受體。在這些受體中，5-HT2A與5-HT1D受體主要位于血管平滑肌細(xì)胞上，當(dāng)機(jī)體內(nèi)源性釋放的5-HT與5-HT2A受體結(jié)合后，可促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，使得血管迅速產(chǎn)生收縮反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，雙龍方可濃度依賴(lài)性地舒張5-HT和U46619所引起的大鼠冠狀動(dòng)脈收縮，有顯著直接擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管的作用。雙龍方舒張血管的作用機(jī)制與抑制電壓依賴(lài)型鈣離子通道開(kāi)放有關(guān)，且能干預(yù)5-HT和TXA2所介導(dǎo)的血管收縮效應(yīng)，推測(cè)雙龍方舒張大鼠冠狀動(dòng)脈的作用與抑制二者受體有關(guān)。

本研究中以大鼠離體微血管組織（冠狀動(dòng)脈）為試驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)一步驗(yàn)證了雙龍方可改善大鼠的心臟微循環(huán)功能。但本研究中所用中藥顆粒劑（人參、丹參）由于提取工藝限制，僅涉及多種水溶性成分，不含脂溶性成分，今后可以考慮從配伍組分學(xué)的角度，以人參、丹參水溶性和脂溶性成分作相關(guān)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及探討。此外，隨著研究微血管技術(shù)的提高與相關(guān)儀器的開(kāi)發(fā)、改進(jìn)，今后的研究也可關(guān)注腦部微血管疾病，以期能發(fā)現(xiàn)新的藥理活性作用，從而為拓展中藥復(fù)方的臨床應(yīng)用范圍提供試驗(yàn)依據(jù)。

志謝：導(dǎo)師李連達(dá)院士生前在雙龍方基礎(chǔ)試驗(yàn)研究方面，傾注了較多心血，有幸作為他的學(xué)生并得到其諄諄教導(dǎo)，不勝感恩！