氯化琥珀膽堿注射液不同溶劑中降解雜質的檢測

馬 延，陳 濤，盧伍黨，趙 妮，李 斐

（西安力邦醫藥科技有限責任公司，陜西 西安 710065）

氯化琥珀膽堿是一種用于靜脈給藥的超短效去極化骨骼肌肉松弛劑，通用名為琥珀膽堿、司可林，化學名為二氯化2′，2-〔（1，4-二氧代-1，4-亞丁基）雙（氧）〕雙〔N，N，N-三甲基乙胺〕二水合物。氯化琥珀膽堿可替代乙酰膽堿，與膽堿能受體的運動終板結合產生去極化，肌松（弛緩性麻痹）作用起效很快（靜脈注射后1 min內起效），單劑量給藥大約可持續4～6 min。氯化琥珀膽堿起效快，肌松完全，代謝迅速，臨床得以廣泛應用，目前尚無一種非去極化肌松藥能完全具備其優點。氯化琥珀膽堿能提供較滿意的氣管內插管條件，已成為使用時間最長的肌松藥，是目前困難插管和緊急插管時唯一被選用的肌松藥[1-7]。但由于本品結構中含有酯鍵，不穩定，易發生水解反應。氯化琥珀膽堿在水溶液中主要水解產生琥珀酸、氯化膽堿和氯化琥珀單膽堿，在丙二醇溶液中主要水解雜質與丙二醇發生反應，產生新的降解雜質。氯化琥珀膽堿中降解雜質文獻[8-9]有報道，但雜質檢測不全。美國藥典委員會（USP）收載的標準中未檢測注射液中的雜質，原料藥標準中對主要降解雜質琥珀酸、氯化琥珀單膽堿和氯化膽堿進行檢測。氯化琥珀膽堿注射液的國內報道文獻和標準中，僅對降解雜質氯化膽堿進行了檢測。本研究中參照USP標準[9]，采用高效液相色譜（HPLC）法檢測氯化琥珀膽堿在不同溶劑注射液中的主要降解雜質。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Thermo Ultimate 3000型高效液相色譜儀，Chromeleon色譜工作站（Thermo Fisher Scientific），Sartorious BS210S型電子天平（德國賽多利斯）。

試藥：乙腈（色譜純，Merck公司，批號為20160824）；戊烷磺酸鈉（批號為20161028）、氯化鈉（批號為20160824）、硫酸（批號為20160504）均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限責任公司；氯化琥珀單膽堿對照品（USPReference standard，批號為H01364）；琥珀酸對照品（Dr．Ehrenstorfer GmbH，批號為91511）；氯化琥珀膽堿對照品（USP Reference standard，批號為R071NO）氯化琥珀膽堿注射液（西安漢豐藥業有限責任公司，水溶劑，批號為1701101；丙二醇溶劑，批號為1701161，規格為每支2 mL∶100 mg）。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu GL柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：緩沖鹽（取戊烷磺酸鈉3．85 g，氯化鈉2．9 g，2 mol／L的硫酸溶液10 mL，置1 000 mL水中，溶解，搖勻）-乙腈（95∶5）；檢測波長：214 nm；流速：1．0 mL／min；進樣量：50μL；柱溫：30°C。

2．2 溶液制備

稱取琥珀酸對照品約12．5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；再各稱取氯化琥珀單膽堿對照品和氯化琥珀膽堿對照品約20 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；分別精密量取貯備液各1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密吸取氯化琥珀膽堿注射液2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2．3 樣品雜質測定

取樣品，按2．2項下方法配制對照品溶液和供試品溶液，分別進樣，并進樣空白溶劑。結果，空白溶劑不干擾雜質測定，各雜質與主峰分離度良好，不同溶劑的氯化琥珀膽堿注射液降解產生不同的雜質。詳見圖1。

2．4 結構解析

USP標準中僅給出降解雜質琥珀酸和氯化琥珀單膽堿。氯化琥珀膽堿注射液（水溶劑）均檢出2個雜質，為琥珀酸和氯化琥珀單膽堿，無未知雜質檢出；氯化琥珀膽堿注射液（丙二醇溶劑）未檢出琥珀酸和氯化琥珀單膽堿，檢出2個含量較高的未知雜質，對其進行結構確認。經液相色譜質譜聯用（LC-MS）檢測，采用ESI離子源，正離子模式進行掃描。在正離子模式下，出現質荷比（m／z）為262．3碎片峰，減少相對分子質量35，推測失去Cl-；出現m／z為197．2碎片峰，推測為氯化膽堿酯鍵斷裂后的[C7H11O5＋Na-H]＋碎片；m／z為297和299處有M峰和M＋2峰的分子離子峰，豐度比為3∶1，符合Cl-特征峰。因此該雜質的相對分子質量為297，與雜質A的相對分子質量一致。在正離子模式下，出現m／z為197．1碎片峰，為單酯斷裂的[C7H11O5＋Na-H]＋碎片峰；同時出現對稱的m／z為139．1和255．0碎片峰，分別為對稱2個酯鍵斷裂的碎片峰，因此該雜質的相對分子質量為234，與雜質B一致。

圖1 高效液相色譜圖

2．5 強制降解

取樣品（批號為1701101），按擬訂色譜條件進行強制降解試驗。

未降解：取樣品5支，混勻，移取2．0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。

酸降解：取樣品5支，混勻，移取2．0 mL，置10 mL容量瓶中，加1．0mol／L鹽酸溶液1mL，放置0．5 h，再加1．0 mol／L氫氧化鈉溶液1 mL中和，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。

堿降解：取樣品5支，混勻，移取2．0 mL，置10 mL容量瓶中，加0．1 mol／L氫氧化鈉溶液0．5 mL，放置10 min，再加0．1 mol／L鹽酸溶液0．5 mL中和，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。

氧化降解：取樣品5支，混勻，移取2．0 mL，置10 mL容量瓶中，加30%雙氧水1 mL，室溫放置1 h，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。

光照降解：取光照樣品（4 500 lx，72 h）5支，混勻，移取2．0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。

高溫降解：取高溫樣品（40℃，1個月）5支，混勻，室溫放置，移取2．0 mL置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。

由試驗結果（圖2）可見，樣品（水溶劑）中，氯化琥珀單膽堿和琥珀酸主要在酸堿及高溫條件下降解產生，且均為主要降解雜質，是由本品結構中的酯鍵斷裂形成。其他條件下，幾乎無雜質降解產生。在各降解條件下，雜質之間及雜質與主峰之間的分離度良好。

2．6 重復性試驗

圖2 供試品溶液（水溶劑）強制降解高效液相色譜圖

取樣品（批號為1701101）5支，混勻，移取2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，平行配制6份，精密吸取50μL，進樣，記錄色譜圖，按外標法計算雜質量。結果供試品溶液中，琥珀酸含量平均為0．06%，氯化琥珀單膽堿平均含量為1．83%，RSD為0．21%（n=6），表明方法重復性良好。

2．7 穩定性試驗

取樣品（批號為1701101）5支，混勻，移取2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，放置室溫條件下，分別于0，2，4，6，8 h時進樣，記錄色譜圖，外標法計算各雜質含量。結果供試品溶液隨著放置時間的延長，琥珀酸的含量均保持在0．05%，氯化琥珀單膽堿含量逐漸水解增大，在8 h內由1．88%增長至1．93%，增長了0．05%。提示供試品溶液8 h內不穩定，需臨用新制。

3 討論

琥珀酸和氯化琥珀單膽堿的檢測中，改變流動相中2 mol／L硫酸溶液的加入量，分別加入10，8，0 mL，不改變其他色譜條件，分別測定流動相的pH，結果為3．09，3．20，4．90。取對照品溶液，分別在不同流動相條件下進樣，結果加入硫酸溶液為0 mL時各雜質不能檢出，加入10，8 mL時各雜質均有較好的分離度。根據預強制降解試驗，樣品溶液在酸性條件下穩定性較好，故選擇加入2 mol／L硫酸溶液的量為10 mL，流動相pH約為3．1。

雜質A與雜質B為氯化琥珀膽堿注射液（丙二醇溶劑）特有的未知雜質，氯化琥珀單膽堿中的羧基與丙二醇中的醇羥基縮合得到新的雜質（雜質A）；琥珀酸中的羧基繼續與兩分子丙二醇反應，得到新的降解雜質（雜質B）。因此，在氯化琥珀膽堿注射液（丙二醇溶劑）中未檢出琥珀酸與氯化琥珀單膽堿，降解產生的琥珀酸與氯化琥珀單膽堿繼續參與反應，與丙二醇溶劑脫水得到雜質A和雜質B。氯化琥珀膽堿在體內經水解酶水解后，代謝產生琥珀酸與氯化琥珀單膽堿[10]，為體內代謝產物，其安全性可預知。雜質A與雜質B為丙二醇溶劑與降解雜質的反應產物，無相關文獻報道其體內的代謝途徑與安全性。以丙二醇為溶劑的注射液，臨床安全性較低[11]。氯化琥珀膽堿注射液（水溶劑）的產品質量優于氯化琥珀膽堿注射液（丙二醇溶劑）。