熱誘導大豆分離蛋白對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

武雅琴，王莉莎，鄒咪，包海蓉,2,3*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(農業部水產品加工貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306)

金槍魚中富含DHA、EPA等多不飽和脂肪酸，營養價值豐富，同時含有豐富的維生素和礦物質。目前，金槍魚的加工主要以生魚片和罐頭為主，在金槍魚罐頭食品的加工過程中將產生大量的碎肉，約占原料的11%左右[1]，除有限的用于罐頭食品的凈重補充外，剩余的均未能很好地利用，但其與魚肉一樣富含蛋白質和不飽和脂肪酸。目前，一部分金槍魚碎肉凝膠化形成凝膠，生產魚丸、魚香腸、魚松等魚糜制品[2]，另一部分金槍魚碎肉組織重組化，黏結成型后制成新型魚肉加工制品[3]。為了改善肉類和肉制品的營養和功能特性，大豆分離蛋白作為非肉蛋白添加劑已被廣泛用于肉類加工業中[4]。

一些研究報道，天然大豆分離蛋白(N-SPI)對肉類蛋白質(如豬肉、牛肉、雞肉和魚肉)的凝膠性質有不利的影響[5-7]，這是因為大豆分離蛋白和肉類蛋白之間的相互作用差。因此，改變大豆蛋白的天然結構是有必要的。加熱是處理大豆蛋白常用的方法，該處理方式引起蛋白質分子結構松散，內部的疏水基團隨之暴露出來并且使得展開的分子發生聚集，并引起蛋白中許多理想的物理化學變化，例如變性(展開)，亞基的離解，活性基團的結合以及促進凝膠形成的聚集作用[8-9]，從而影響大豆蛋白的功能性質。JIANG等[7]研究了極端pH處理大豆分離蛋白對豬肉肌原纖維蛋白凝膠中結構的影響，WANG等[15]報道了豬肉肌原纖維蛋白與熱誘導大豆分離蛋白相互作用對凝膠特性的影響，但對改性大豆蛋白與魚肉之間相互作用的研究機理研究甚少。

本實驗以大豆分離蛋白為原料，經過60、80和95 ℃熱處理，研究不同熱處理后的大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)與金槍魚肌原纖維蛋白(myofibrillar protein, MP)復合凝膠特性，實現動植物蛋白之間的平衡協調，從而為生產加工產品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚碎魚肉，購于浙江大洋世家股份有限公司，分別稱取5.0 g金槍魚碎魚肉用聚乙烯自封帶密封好，凍藏于-60 ℃超低溫冰箱中，實驗前取出樣品放置于4 ℃低溫培養箱解凍至中心溫度-5 ℃時取樣，大豆分離蛋白，購于山東萬得福生物科技有限公司；哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-100CL型低溫培養箱，上海一恒科技儀器有限公司；GL-20B高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；MCR301流變儀，奧地利安東帕公司；D-130電動勻漿機，Wiggens有限公司；UV1100型紫外分光光度計，廣州罡然機電設備有限公司；SG2-ELK研究用酸度計，梅特勒-托利多公司；FA2004 型電子分析天平，南京東邁科技儀器有限公司；AL104-IC型分析天平，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司。

1.3 大豆分離蛋白的預處理

通過溶解10 g的SPI水溶液質量濃度為50 g/L制備蛋白質溶液，并將該溶液調節至pH=7.0。通過在60、80和95 ℃下攪拌加熱溶解的蛋白質溶液30 min。 熱處理后，將樣品在10 000 r/min離心30 min 以除去不溶部分，然后冷凍干燥24 h[7]。

1.4 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參考KATOH等[10]并作適當的修改。準確稱取5.0 g魚肉，加40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內含0.16 mol/L KCl，20% TritonX-100，pH 7.5),均質(12 000 r/min，每次20 s，間隔10 s，重復4次)，離心(4 ℃，5 000 r/min，10 min)除上清液，繼續加40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內含0.16 mol/L KCl，pH 7.5)清洗沉淀。均質-離心重復2次，用4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液清洗沉淀，離心棄上清液用8倍體積的0.1 mol/L NaCl清洗沉淀，紗布過濾，濾液離心，沉淀即為肌原纖維蛋白樣品，4 ℃下冷藏備用。

1.5 肌原纖維蛋白含量的測定

雙縮脲法測定肌源蛋白的濃度[11]。

1.6 制備MP-SPI復合凝膠

將MP溶解在0.6 mol/L NaCl和50 mmol/L PIPES(pH 6.25)中，天然或熱處理(60，80和95 ℃)SPI加入到MP溶液形成MP-SPI(質量比為3∶1，最終蛋白質量濃度45 g/L)復合蛋白質溶液。將蛋白質溶液在80 ℃的恒溫水浴中加熱30 min形成MP-SPI復合凝膠。

1.7 流變特性

取一定量的MP和SPI混合蛋白溶液，置于安東帕流變儀的載物臺與圓形平板(直徑為4 cm)之間，用液體硅油密封樣品以免水分蒸發影響測定結果。對復合蛋白進行溫度掃描，測定的主要參數是：剪切頻率為0.1 Hz，剪切應變0.02，狹縫為1 mm，掃描溫度為20～80 ℃，升溫速率為1.5 ℃/min。

1.8 持水力的測定(WHC)

在SALVADOR[12]的基礎上測量了凝膠的持水能力(water holding capacity, WHC)，并進行了一些修改。將凝膠在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min。WHC按式(1)計算。

(1)

1.9 質構特性

將制備的復合蛋白凝膠在4 ℃下放置12 h，采用TA-XT Plus質構儀測定凝膠樣品的質構特性。實驗前，將樣品在室溫下平衡1 h。使用的質量參數為：探針P/0.5，壓縮距離：5 mm，測前速度：1.0 mm/s，測后速度：1.0 mm/s，施加力：5 g，數據采集速率：200 pps。硬度(hardness)：第一次壓縮所需的峰值力(N)。黏性(cohesiveness)：第二次壓縮曲線下完成的有效功與第一次壓縮曲線下完成的有功功率效功之比(無量綱)。彈性(springiness)：第一次壓縮后樣品恢復的距離(mm)。咀嚼性(chewiness)：硬度×黏性×彈性(Hd×Ch×Sp) (N·mm)。

1.10 化學力的測定[13]

為了確定復合凝膠的化學力，取2.0 g凝膠樣品與18 mL溶解溶液均質30 s。溶解液為：8 mol/L尿素，50 mmol/L磷酸鈉(pH 7.0)(檢測氫鍵)；0.5% SDS，50 mmol/L磷酸鈉(pH 7.0)(檢測總非共價力)；0.25% β-巰基乙醇，50 mmol/L磷酸鈉(pH 7.0)(檢測二硫鍵)。將混合溶液在80 ℃加熱30 min，冷卻至室溫，然后以5 000 r/min離心15 min。用不同溶解緩沖液處理后提取蛋白質的量來表示凝膠中的主要作用力。

1.11 SDS-PAGE凝膠電泳

參照NIU[14]的不連續電泳方法，將1 mL的樣品溶液與等體積的含有100 mmol/L Tris-HCl(20%甘油，4% SDS，0.2%溴酚藍，3% DTT，pH 6.8)混合，將混合物煮沸3 min以完全溶解蛋白質，在室溫下冷卻，然后用4%濃縮膠，4%～15%分離膠，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

1.12 數據處理

所有試驗均平行重復3次，實驗結果以“平均值±標準差”表示，數據統計分析采用SPSS 18.0軟件對數據進行ANOVA差異顯著性差異，P<0.05為顯著性差異。采用Excel軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 流變特性

如圖1所示,復合蛋白溶液的G′(彈性模量)在20 ℃至80 ℃加熱過程中分成3個階段，42.8 ℃之前，凝膠預備區(gel setting)；42.8～46.3 ℃，凝膠弱化區(gel weakening)；46.3～80 ℃，凝膠加強區(gel strengthening)[15-16]。G′在35.2 ℃之前緩慢增加，在約35.2 ℃后開始顯著增加，此時肌球蛋白結構發生變化，導致肌球蛋白長絲的交聯。G′在42.8 ℃時達到最大值。進一步加熱后，G′值顯著下降，這是因為輕酶解肌球蛋白輕鏈開始變性，部分肽鏈解螺旋，增加了蛋白的黏性，同時不同程度上破壞了蛋白的網絡結構[17]。46.3 ℃時G′回落到最小值并迅速上升，是由于共價二硫鍵和疏水相互作用而形成永久的、不可逆交聯的長絲和穩定的三維網絡結構[18]。肌球蛋白重大的結構性轉變已經發生，彈性在黏彈性體系中占主導地位。

由圖1可知，MP-N-SPI的儲能模量比單純MP低，可能是N-SPI加入MP對凝膠有不好的影響，由于對肌球蛋白相互作用的干擾，具有緊密結構的天然SPI對MP凝膠化具有不利影響[19],這PETRUCCELLI等[20-21]的結果相一致。JIANG等[13]報道，高濃度的初始SPI對MP凝膠化有不利影響。SUN等[22]也推測，非肉類蛋白質在加熱過程中減少了肌球蛋白重鏈的聚集，導致凝膠減弱效應。預熱SPI與MP復合凝膠的儲能模量都比MP-N-SPI高，說明加熱打開SPI內部結構，與MP復合后相互作用，改善了復合蛋白的凝膠性。其中MP-SPI(80 ℃) 的儲能模量有顯著提升，這可能是加熱可導致天然蛋白質的解折疊和掩埋的極性基團的暴露，增強了SPI與肌球蛋白重鏈之間的疏水相互作用，熱處理SPI中反應性側鏈基團促進了MP和SPI蛋白質的相互作用，導致更強和更有彈性的最終凝膠結構。

圖1 復合蛋白的流變性Fig.1 Rheological properties of complex proteins

2.2 持水力的測定

凝膠形成過程中會形成三維網狀結構，水將被捕獲在網狀結構中，持水力(WHC)是肉品質一項重要的性質，表明蛋白質結合水的能力，通常用于評估肉類及其產品的質量和產量。如圖2所示，相對于單純MP，復合凝膠的持水力都有顯著提升，其中MP-SPI(80 ℃)混合凝膠持水力比單純MP凝膠增加了52.79%， 這可能是由于加熱可導致天然蛋白質的解折疊和掩埋的極性基團的暴露，通過疏水締合增強蛋白質-蛋白質相互作用，適度的疏水相互作用有利于凝膠基質的形成[23]，并且形成的基質具有更強的捕獲水的能力。但是在MP-SPI(95 ℃)凝膠中，持水力相對于MP-SPI(80 ℃)有所降低，可能是由于溫度升高，7 s和11 s兩種球蛋白同時變性后，其亞基之間發生了聚集[24]，聚集可以減少蛋白質的表面面積和極性氨基酸對水結合的有效性，從而持水力下降。

MP-單純MP；Native-MP-N-SPI;60 ℃-MP-SPI(60 ℃); 80 ℃-MP-SPI(80 ℃);95 ℃-MP-SPI(95 ℃)圖2 復合蛋白凝膠持水力的測定Fig.2 Determination of water holding capacity of composite protein gel注：不同小寫字母表示差異顯著。

2.3 質構特性

質構特性是凝膠的一個重要特性，決定了凝膠的品質。通過TPA獲得復合凝膠的4個參數：硬度，彈性，咀嚼性和凝聚性。表1顯示了復合凝膠的TPA結果。

表1 復合蛋白凝膠的質構特性差異Table 1 Differences in texture properties of composite protein gels

注：同列數據中右上標字母相同者，表示差異不顯著(P>0.05)。

根據表1結果計算得知，相對于單純MP，MP-N-SPI的硬度增加了37.78%，凝聚性增加了10.85%。相對于N-SPI-MP，MP-SPI(95 ℃)和MP-SPI(80 ℃)中硬度顯著增加，分別是72.21%和26.80%(P<0.05)。 咀嚼性也顯著改善，分別增加了25.19%和25.3%。這可能是由于熱誘導引起SPI表面疏水性增加，增強了SPI與肌球蛋白重鏈之間的疏水相互作用，形成了剛性、彈性穩定的網絡結構，從而提高了復合凝膠蛋白的硬度和彈性。然而，MP-SPI(60 ℃)樣品在硬度或彈性方面沒有顯著改善。對于這種現象的合理解釋是SPI在60 ℃下加熱，由于其結構緊湊，阻礙其與肌球蛋白之間的相互作用，對MP凝膠化具有不利影響[15]。MP-SPI(95 ℃)在硬度和彈性方面顯著提升，可能是因為大豆分離蛋白中球蛋白的酸性和堿性亞基在95 ℃解離，解離的堿性亞基可通過疏水相互作用與肌球蛋白相互作用，從而提高了硬度和彈性[7]。

2.4 化學力的測定

與含有不同破壞劑的溶解溶液混合后，測定MP-SPI復合凝膠蛋白質的溶解度，鑒定凝膠之間的相互作用以及可能產生的物理化學鍵變化。圖3顯示，當凝膠與8 mol/L尿素混合時，其破壞分子之間的氫鍵，用尿素處理的預熱SPI和MP復合凝膠的蛋白質溶解度低于MP-N-SPI，用尿素處理的預熱SPI和MP復合凝膠的蛋白質溶解度隨著處理溫度的升高而降低，可能是蛋白質加熱到其變性溫度以上會導致蛋白質中的三級和氫鍵結構的完全破壞[25]，導致蛋白質溶解度降低，結果表明，氫鍵不是復合凝膠結構中的主要貢獻作用。

MP-單純MP；Native-MP-N-SPI；60 ℃-MP-SPI (60 ℃), 80 ℃-MP-SPI(80 ℃);95 ℃-MP-SPI(95 ℃)圖3 復合蛋白凝膠化學力的測定Fig.3 Determination of chemical strength of complex protein gel注：同一顏色的柱狀圖，字母上標相同者，表示差異不顯著(P>0.05)。

當凝膠溶解在0.5% SDS溶液中，MP-SPI(80 ℃)和MP-SPI(95 ℃)的蛋白溶解性顯著提高，可能是疏水殘基對混合凝膠中處理的SPI有積極作用，說明疏水相互作用在穩定蛋白質的結構中起重要作用，而MP-N-SPI和MP-SPI(60 ℃)的蛋白質溶解度卻低于80 ℃和95 ℃預熱處理的復合蛋白凝膠，這可能是由于消耗了大部分SDS用于解開緊湊的SPI結構，而不是松散凝膠網絡中的疏水締合作用[15]。隨著SPI預熱溫度的升高，混合凝膠蛋白的溶解性增加，說明加熱導致天然蛋白質的解折疊和掩埋的極性基團的暴露，從而進一步增強SPI和MP之間的相互作用。另一方面，用β-巰基(β-ME)處理復合凝膠，用來說明二硫鍵的作用，結果顯示，在MP-SPI(60 ℃)、MP-SPI(80 ℃)和MP-N-SPI復合凝膠的蛋白質溶解度沒有實質差異，MP-SPI(95 ℃)的蛋白質溶解度降低，這表明二硫鍵不是負責增強復合凝膠強度的主要化學力。本實驗研究表明預熱大豆蛋白與MP的凝膠網絡形成主要是疏水相互作用的結果，而KANE等[26]研究表明豆科蛋白的網絡形成與氫鍵和疏水相互作用密切相關。

2.5 SDS-PAGE電泳分析

離心是消除MP凝膠基質中非貢獻蛋白質的有效方法。通過離心可以除去凝膠中的弱結合以及非結合類的蛋白，離心后上清液中的這些弱結合蛋白可以通過SDS-PAGE容易地鑒定。由圖4可以看出，所有蛋白中都含有肌鈣蛋白(troponin-T)和原肌球蛋白(tropomyosin)的條帶，說明它們不是主要參與復合凝膠蛋白的形成，肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)和肌動蛋白(actin)消失，表明MHC和肌動蛋白主要參與凝膠網絡結構的形成。而對于MP-N-SPI混合凝膠，與單純MP凝膠沒有明顯的區別，JIANG和XIONG等[15]指出，這種現象主要是由于N-SPI亞基沒有參與MP-N-SPI復合凝膠的形成。相對于MP-N-SPI，MP-SPI(60 ℃)的條帶變窄，可能是由于預熱的大豆分離蛋白與MP之間發生交聯。而MP-SPI(80 ℃)和MP-SPI(95 ℃)的肌鈣蛋白和原肌球蛋白條帶相對于MP-N-SPI，MP-SPI(60 ℃)變淺，可能是于部分肌鈣蛋白和原肌球蛋白參與預熱SPI凝膠網絡結構的形成，所以離心上清液中檢測出的條帶比較淺。

圖4 復合蛋白凝膠的電泳條帶圖Fig.4 Electrophoresis band diagram of composite protein gel

3 結論

本實驗通過預熱處理SPI加入到MP中，研究了SPI-MP復合蛋白之間的流變特性、持水力、質構特性、化學力等性質。結果表明，預熱SPI(80 ℃、95 ℃)可以顯著增強MP和SPI之間的相互作用，改善復合凝膠的凝膠特性。由SDS-PAGE可以發現，MP-N-SPI與單純MP條帶無明顯差別，同時動態流變學的結果顯示，MP-N-SPI的儲能模量低于單純MP，不利于復合凝膠的形成。疏水相互作用是形成復合凝膠的主要化學力，而MP-N-SPI和MP-SPI(60 ℃)與80 ℃和95 ℃預熱處理的復合蛋白凝膠有顯著性差異，MP-SPI(80 ℃)顯著提高了混合凝膠的持水性(P<0.05)，儲能模量值(G′)(P<0.05)顯著提升，但是MP-SPI(95 ℃) 的硬度和咀嚼性比較好。可以根據實際生產需要，選擇合適的預處理溫度。實現動植物蛋白之間的優化。