發酵時間對樺褐孔菌主要活性成分的影響

梁家旗，陳江，王蘭英，趙靜*，李紹平

1(吉林大學 珠海學院 藥學與食品科學學院，廣東 珠海，519041) 2(中藥質量研究國家重點實驗室(澳門大學)，中國 澳門，999078)

樺褐孔菌是一種極具開發價值的藥食兩用的真菌[1]。樺褐孔菌野生資源十分有限,近年來價格逐漸升高，因此,人工培養樺褐孔菌非常必要,而采用液體發酵生產樺褐孔菌菌絲體是條有效的途徑,可以為研究和開發樺褐孔菌提供充足的原材料[2-3]。如何提高活性成分的產量、優化培養技術依然是人工培養過程中的研究熱點。目前大部分研究著重于優化培養條件與檢測活性成分[4]，而對幾大類活性成分在發酵過程中是如何累積變化的報道卻少見。本研究以樺褐孔菌為研究對象，進行液體發酵，通過苯酚硫酸法及薄層色譜法分析樺褐孔菌中的活性成分，擬確定樺褐孔菌多糖、三萜、甾醇類等[5]活性成分在液體發酵過程中的含量變化情況，確定發酵培養活性物質的最佳時間，通過與子實體比較，了解樺褐孔菌發酵培養物及子實體中的有效成分的差異，對進一步研究和開發樺褐孔菌具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌CFCC6584菌株購自中國林業微生物菌種保藏管理中心；苯酚、硫酸、甲醇均采用國產分析純；DPPH、茚三酮購自sigma公司；層析板購自德國默克；野生樺褐孔菌子實體保存于澳門大學中華醫藥研究院。

1.2 儀器與設備

Bsc-A2超凈工作臺，美國Thermo公司；HVE-50高壓滅菌鍋，美國HIRAYAMA公司；C75紫外分光光度計，Chromato-Vue公司；Centrifuge 5415D離心機，Eppendorf公司；11-06-MRC恒溫搖床，MRC公司；FD-02凍干機，ilShinBioBase公司；El3002電子天平，天恒科技有限公司；DENSITOMERCD60薄層掃描儀，DESAGA公司。

1.3 菌株活化

PDA固體培養基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖 30，酵母粉10，MgSO41，KH2PO41，瓊脂 30。具體方法參考文獻[6]。取4 ℃保存的樺褐孔菌菌種，無菌操作取菌塊接種到PDA培養基中。

1.4 菌株發酵培養

1.5 多糖含量測定

1.5.1 樣品制備

收集凍干菌絲體，用多功能粉碎機粉碎后過篩，取0.1 g菌絲體按液料比300∶1加入甲醇回流80 ℃提取2 h[1,8-9]，轉移到50 mL離心管中，離心取25 mL 上清液，加入甲醇洗滌再次離心。殘渣再加甲醇清洗，重復3次。取甲醇脫脂后的菌絲體，按100∶1(以原來重量為準)加入去離子水，恒溫水浴鍋內浸提4.5 h、85 ℃， 提取液10 000 r/min離心10 min，取3 mL上清液，定容到50 mL容量瓶，用于多糖含量測定。

1.5.2 苯酚硫酸法檢測多糖含量[10]

取無水葡萄糖對照品5 mg，置于50 mL容量瓶中，取0、0.5、1、2、3、4、5、6 mL定容至10 mL，倒到離心管中，分別取其中1 mL至試管中，再取出5%(質量分數)苯酚[11]0.5 mL搖勻，迅速加入2.5 mL濃H2SO4搖勻，靜置10 min后，于40 ℃水浴鍋中保溫15 min，冷卻至室溫，490 nm下檢測吸光度值并記錄，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，根據測定結果繪制標準曲線，取1 mL待測樣品按照上述方法分別加入苯酚與濃H2SO4，490 nm下檢測吸光度值，代入標準曲線計算得到多糖含量。

1.6 TLC法檢測子實體與菌絲體三萜甾醇

1.6.1 樣品制備

取凍干后的菌絲體與子實體，利用1.5.1中相同方法進行甲醇提取后，轉移到50 mL離心管中，離心取25 mL上清液轉移到合適容器中，用N2吹干后加入0.5 mL甲醇溶解。吸取復溶后的溶液，保存于2 mL 離心管中，用于HPTLC分析。

1.6.2 HPTLC法分析樣品中的三萜甾醇

取薄層板，將制備好的待檢測樣品于40 ℃點樣，設置點樣條件：長度為5 mm，間距5 mm，點樣量6.5 μL。按照V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=5∶1配制層析液，預平衡20 min，層析完畢后采用硫酸香草醛顯色[12]。并分別在540 nm和365 nm下觀察實驗結果進行拍照，同時使用薄層掃描儀進行掃描。利用掃描得到的樣品總峰值計算菌絲體三萜甾醇相對含量，如公式(1)。

(1)

1.7 子實體與菌絲體抗氧化活性比較

取薄層板分開左右2個區域，將子實體、發酵4 d、 9 d菌絲體樣品于薄層板左右區域均進行點樣，使用與1.6.2相同的方法進行薄層層析，左邊區域利用硫酸香草醛顯色，右邊區域利用DPPH顯色，于白光下進行拍攝并利用肉眼觀察分析[13]。根據相同RF值的斑點顯色結果對比樺褐孔菌子實體與菌絲體的抗氧化活性成分。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間對樺褐孔菌菌絲體生長的影響[14]

如圖1所示，隨著發酵時間的延長，菌絲球由小變大，逐漸增多，菌絲密度在發酵過程中明顯增加，且發酵液顏色隨培養時間延長逐漸加深，培養至12 d之后培養液基本渾濁，菌球消失。

A-培養3 d的菌絲體；B-培養6 d的菌絲體；C-培養9 d的菌絲體；D-培養12 d的菌絲體圖1 不同發酵時間對樺褐孔菌發酵過程的影響Fig.1 Effects on mycelia changes of Inonotus obliquus in different fermentation times

2.2 生物量與多糖含量變化

如圖2所示，菌絲體中的多糖含量在發酵的前5 d變化較小。

圖2 不同發酵時間對樺褐孔菌的多糖含量與生物量的影響Fig.2 Effect of polysaccharide content and biomass of Inonotus obliquus in different culture days

培養至第6天，菌絲體中的多糖含量有明顯的升高，此時菌絲體處于對數生長期，其汲取營養增大生物量的同時，使得培養基中的還原糖逐步轉化為多糖，在第8天多糖總產量達到最大值，為0.31 g/L。8 d之后菌絲體中多糖含量處于相對平穩下降狀態，培養液中營養缺乏，菌絲體開始自溶，其中的多糖含量逐漸降低，最后達到平衡并接近于子實體中的含量(29.05 mg/g)。

2.3 發酵過程成分變化

如圖3所示，隨發酵時間的延長，樺褐孔菌次級代謝產物不斷增加，并且發酵后的菌絲體與子實體的成分相似，而菌絲體提取物可觀察到子實體提取物中未檢測到的成分。

a-540 nm下拍攝，b-365 nm下拍攝圖3 樺褐孔菌培養第3～12天的薄層色譜圖Fig.3 TLC analysis results of Inonotus obliquus cultivation from 3 days to 12 days

采用ZHAO等已發表文獻中方法，利用薄層掃描分析對比子實體與發酵菌絲體中三萜甾醇的相對含量(圖4)[15]，根據顯色反應并結合現有報道，推斷出樺褐孔菌主要成分A、B、C均為三萜或甾醇[16]。

圖4 培養第3～12天菌絲體三萜甾醇相對含量Fig.4 The relative content of triterpenes and sterols in mycelia cultivation from 3 days to 12 days

可見樺褐孔菌菌絲體的總三萜甾醇含量于培養第9天左右達到最高值，約為子實體的77%。之后，總含量開始下降，究其原因，可能與營養基質消耗殆盡，菌絲生長受到抑制，菌絲自溶導致了相應產物含量降低有關。由此，判斷樺褐孔菌菌絲體最佳發酵時間為9 d。

2.4 樺褐孔菌菌絲體提取物的抗氧化活性成分比較

樺褐孔菌提取物的抗氧化薄層顯色結果如圖5所示，發酵4、9 d后的樺褐孔菌菌絲體提取物通過DPPH顯色后能觀察到明顯的白色條帶，證明經過發酵的樺褐孔菌菌絲體具有子實體不含有的抗氧化三萜成分[17]。該三萜于TLC香草醛顯色下條帶顏色較深，提示在其菌絲體中含量較高，原因可能是由于人工培養過程中，菌絲體得到充分的營養，從而產生較多此種代謝產物，而野生樺褐孔菌子實體由于生長環境等原因并未產出或較少產出此類成分。

A-子實體；B-培養4 d的菌絲體；C-培養9 d的菌絲體圖5 樺褐孔菌子實體與菌絲體抗氧化活性成分對比Fig.5 Comparison of antioxidant components between fruiting bodies and mycelia

3 討論

樺褐孔菌菌絲體與天然資源一樣具有調節人類免疫力的多種功能，在國外現已廣泛應用于食品與保健品行列，其中樺褐孔菌多糖、三萜、甾醇類等是它的主要活性成分[18]。如何在人工培養過程中提高生物活性成分的產率，開發更多活性成分，依然是人工樺褐孔菌培養工程中的核心內容。近年來，國內對樺褐孔菌菌絲體的研究主要集中在多糖方面[19]，針對樺褐孔菌菌絲體發酵條件的研究主要利用多糖含量作為發酵指標進行優化，很少將三萜甾醇的含量作為考察對象。董愛榮等分析比較了菌絲體及子實體粗多糖含量分別為7.43、2.31 g/100 g，而本文測定的菌絲體及子實體中的多糖含量分別為5.14、2.95 g/100 g，與其測定結果相近。ZHAO等對樺褐孔菌進行了研究，從中分離出了3種新的具有良好抗腫瘤活性的三萜[20]，可見樺褐孔菌中的三萜甾醇具有深遠的研究價值。本文采用液體深層發酵法對樺褐孔菌進行培養，每天收集菌絲體并檢測其中多糖、三萜、甾醇等主要活性成分的含量，發現隨著培養時間的延長，菌絲體的生物量逐漸增多，與以往報道一致[21]，培養至第9天時達到最大，且發酵液顏色逐漸加深，而樺褐孔菌多糖、三萜、甾醇含量先增加后減少，在第9天左右達到最大值。結合形態學觀察，可能是由于隨著樺褐孔菌液體發酵時間延長，營養物質利用完后，菌絲體出現自溶，導致活性成分含量下降。據此確定，培養至第9天即進行發酵物的收集可以獲得最多的活性物質。而本文首次利用HPTLC分析法，利用DPPH顯色法，確定樺褐孔菌菌絲體發酵過程中可以產生子實體不具有或含量極少的抗氧化三萜成分，具體原因有待于進一步研究。本研究闡明了活性成分在發酵體系中的代謝變化，并確定了液體發酵的最佳收集時間，對人工培養樺褐孔菌菌絲體獲得較高活性物質提供參考，對進一步開發樺褐孔菌功能產品具有重要的意義。