高效液相色譜法同時檢測啤酒中的葎草靈酮、希魯酮和異α-酸

楊朝霞，李梅，盛賢斌， 董建軍

1(啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，山東 青島，266061)2(青島啤酒股份有限公司，山東 青島，266061)

苦感是啤酒區別于其他酒種最重要的風味特征之一。啤酒的苦味物質來源復雜，主要來自于酒花的苦味酸(α-酸和β-酸)、以及苦味酸的異構化、氧化、降解等產物[1-5]。通常情況下，最受釀酒師們關注的是酒花α-酸在麥汁煮沸過程的異構化產物——異α-酸，因其苦感強度和含量較高，成為Lager啤酒中最重要的苦味物質；另外，異α-酸的還原制品(二氫、四氫和六氫異α-酸)也具有不同的苦感強度和苦味特性，可在發酵后期少量添加用于苦感修飾。國內對啤酒中苦味物質的檢測方法研究多集中在異α-酸及其還原制品[6-8]。

近年來，隨著現代分析技術的應用，對苦味酸氧化物的物質組成、結構鑒定取得了較大進展，諸多新型的氧化、衍生產物得到確認[9-12]。在眾多苦味酸衍生物中，α-酸氧化物——葎草靈酮和β-酸氧化物——希魯酮是目前較受釀酒師們關注的新型苦味物質。特別是在高酒花添加量的啤酒品類(如India Pale Ale，IPA)中，葎草靈酮和希魯酮的含量可達幾個～幾十個毫克級，是僅次于異α-酸的苦味物質，這與其特殊的酒花添加工藝和添加量有關。有文獻報道，葎草靈酮和希魯酮的苦感強度分別可達到異α-酸的66%和84%[13]。圖1顯示了源自酒花的主要苦味物質[13]，包括α-酸、β-酸及其主要的異構化和氧化產物，其中每一類化合物都因其R-取代基的不同，成為一系列結構相似的同系物(如α-酸主要包括：合葎草酮、律草酮、加律草酮)。

1-α-酸；2-異α-酸；3-葎草靈酮；4-β-酸；5-希魯酮；a、b、c為R-的不同取代基圖1 源自酒花的主要苦味物質Fig.1 Bitter compounds of interest and their origins

對于葎草靈酮和希魯酮的檢測，國外文獻報道中是通過將酒花浸膏中的α-酸和β-酸進行提純，分別獲得含量較高的α-酸和β-酸的浸膏，然后通過強氧化劑(如過氧化氫異丙苯)進行氧化，經提純后得到純度較高的葎草靈酮和希魯酮，作為液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析的標準品[9,13-14]。圖2為提純后的葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的紫外吸收光譜[13]。啤酒樣品經過液液萃取等方式富集后，利用HPLC進行定性定量[14]。該方法得到葎草靈酮和希魯酮純度高，有利于后續對樣品中待測組分的定性和定量；但缺點是首先要對酒花原料進行提純，且使用強氧化劑，試驗條件要求高，操作步驟繁瑣，普通實驗室難以實現，尚無商業化產品。目前國內在此方面尚未開展研究。

圖2 異α-酸、葎草靈酮和希魯酮的紫外吸收光譜Fig.2 Absorbance spectra of isocohumulone, cohumulinone and cohulupone

本文采用高甲酸酒花顆粒作為原料，在高溫下進行空氣氧化，獲得酒花苦味酸氧化物的混合物；經過乙醇浸提后通過HPLC進行分離，結合文獻報道的葎草靈酮和希魯酮的色譜圖和色譜峰的紫外光譜特性進行定性，并以此作為HPLC分析的定性參考標樣。同時，結合與葎草靈酮結構相似的商業化異α-酸標準品進行相對定量。啤酒樣品則通過固相萃取(solid-phase extraction, SPE)方式進行前處理，將其中的葎草靈酮、希魯酮和異α-酸進行富集濃縮后進行HPLC定量分析。本方法操作簡單，重現性強，可用于啤酒中葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的同時檢測，為研究不同品種啤酒苦味物質組成和各組分對苦感的影響提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C18和PEP固相萃取SPE柱(Supelclean ENVI-18，3 mL，Supelco公司)；高甲酸Herkules酒花顆粒(其中含有質量分數為18%的α-酸18%、質量分數為5%的β-酸，斯丹納酒花公司)；啤酒樣品均為市售啤酒。

乙腈(色譜純，Burdick & Jackson)，無水乙醇(分析純，南京化學試劑)，磷酸(質量分數85%，國藥集團)，異-α酸標樣(質量分數64.3%，American Society of Brewing Chemists)。

1.2 儀器與設備

Alliance e2695 液相色譜儀、2998二極管陣列檢測器，美國Waters公司；Milli-Qntegral 5超純水機，美國Millipore公司；6110 Balance電子天平，德國Sartorius公司。

1.3 參考標樣制備

將粉碎后的酒花顆粒置于60 ℃烘箱中，高溫空氣氧化0～4 d。將氧化產物用乙醇浸提，利用HPLC進行分析，采集每個色譜峰從200～400 nm的紫外吸收光譜，通過對比文獻中已定性的葎草靈酮和希魯酮的紫外吸收光譜定性分析氧化產物中的葎草靈酮和希魯酮，從而得到參考標樣。

1.4 儀器條件

色譜柱：Alltima C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測波長：260 nm；進樣量：10 μL；流動相: A體積分數為0.05%的磷酸溶液，經過濾后超聲脫氣；B為乙腈，高純He脫氣；流速：1.0 mL/min。梯度洗脫程序：0～40 min，90%～48%A；40～45 min，48%A；45～49 min，48%～25%A；49～55 min，25%～15%A；55～56.5 min，15%A；56.5～57.5 min，15%A～90%A；57.5～65 min，90%A。

1.5 樣品前處理

將脫氣后的啤酒分別通過SPE-C18和SPE-PEP小柱進行吸附，分別使用體積分數為0、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇洗脫液進行洗脫，對比二者對目標物的吸附效果，確定樣品前處理條件。

2 結果與分析

2.1 葎草靈酮和希魯酮的參考標樣的制備和定性

2.1.1 葎草靈酮和希魯酮的參考標樣的制備

將高甲酸酒花顆粒(α-酸18%、β-酸5%)粉碎后置于60 ℃烘箱中高溫空氣氧化，0～4 d每天取樣，HPLC分析α-酸和β-酸的衰減[15]，見表1。

從表1可以看出，在60 ℃時隨著氧化時間的延長，α-酸和β-酸的各組分都在逐漸衰減，在氧化第2天各組分的衰減都已達90%以上，因此確定酒花顆粒的氧化條件為60 ℃高溫空氣氧化2 d。

2.1.2 參考標樣的定性

將2.1.1中氧化2 d的酒花顆粒經過無水乙醇浸提30 min后，進行HPLC分析。采用分離效率較高的Alltima C18色譜柱對酒花氧化物的乙醇浸提液進行分離，采集每個色譜峰從200～400 nm紫外吸收光譜。結合文獻報道中酒花顆粒氧化后在Alltima C18色譜柱分離的色譜圖[4]，以及葎草靈酮和希魯酮的紫外吸收光譜[3]，對浸提液中這2種氧化物進行定性分析。

表1 60 ℃空氣氧化條件下酒花顆粒中α-酸和β-酸的衰減Table 1 Attenuation of α-acid and β-acid in hop pellets in 60 ℃ air

注：每類酒花苦味酸都是由一系列結構相似的同系物組成。

圖3和圖4分別為葎草靈酮的4個主要組分(L1、L2、L3、L4)在260 nm的HPLC譜圖和200～400 nm的紫外光譜圖。圖5和圖6分別為希魯酮的2個主要組分(X1、X2)在330 nm的HPLC譜圖和200～400 nm 的紫外吸收光譜圖。

圖3 葎草靈酮(L1～L4)的HPLC譜圖(260nm)Fig.3 HPLC chromatogram of humuliones

圖4 葎草靈酮(L1～L4)的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of humuliones

該方法簡便易行，雖未獲得高純度的葎草靈酮和希魯酮的獨立標樣，但在對實際樣品分析時，利用這些已定性的組分的出峰時間和紫外光譜來對樣品中的待測組分進行定性，同時結合與葎草靈酮結構相似且含量確定的異-α酸標樣進行相對定量測定，可以滿足對啤酒中葎草靈酮和希魯酮開展初步研究的需求。

圖5 希魯酮(X1～X2)的HPLC譜圖(330 nm)Fig.5 HPLC chromatogram of hulupones

圖6 希魯酮(X1～X2)的紫外吸收光譜Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of hulupones

2.2 啤酒樣品SPE前處理方法選擇

啤酒基質復雜，其中葎草靈酮和希魯酮的含量不高，且在儀器上的響應較低，需進行樣品前處理，富集濃縮后上機分析。另外，為了加強檢測方法的實用性，希望能夠在1次分析中完成對啤酒中主要的苦味物質——葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的同時檢出。

考慮到葎草靈酮和希魯酮的極性均強于異α-酸，選擇C18柱(非極性)、PEP柱(中等極性)2種SPE柱進行樣品前處理試驗，選擇適宜的洗脫溶劑比例(乙腈-水溶液，乙腈體積分數從0到100%遞增)。實驗表明，這兩種SPE柱都可以完全吸附啤酒樣品中的葎草靈酮、希魯酮和異α-酸，但在洗脫時二者有所差別，待測組分在C18和PEP SPE洗脫曲線見圖7。

A-葎草靈酮、希魯酮在C18柱的洗脫曲線；B-異α-酸在C18柱的洗脫曲線；C-葎草靈酮、希魯酮在PEP柱的洗脫曲線；D-異α-酸在PEP柱的洗脫曲線圖7 待測組分在C18柱和PEP柱的洗脫曲線Fig.7 The elution curves of components on C18 and PEP SPE cartridges

C18SPE柱：乙腈40%(體積分數)，葎草靈酮開始析出；乙腈50%，希魯酮和異α-酸析出；乙腈90%，葎草靈酮、希魯酮和異α-酸達到最大值。

PEP SPE柱：乙腈50%，葎草靈酮、希魯酮和異α-酸析出；乙腈80%，希魯酮達到最大；乙腈90%，葎草靈酮達到最大；乙腈100%，異α-酸達到最大值。

從洗脫流出液中待測組分的峰面積來看，C18柱對于葎草靈酮和異α-酸的洗脫效果明顯優于PEP柱；對希魯酮的洗脫效果二者相差不大。一方面，由于葎草靈酮和異α-酸的極性相對較弱，更適合用非極性的C18柱進行前處理；另一方面，PEP柱為官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱，具有親水性和憎水性基團，對各類極性、非極性化合物具有較均衡的吸附作用，但由于其吸附能力遠高于C18鍵合硅膠(3～10倍)，因此在洗脫時相比C18柱更加困難。

最終確定用C18SPE柱進行樣品前處理。具體步驟如下：

固相萃取用試劑：A液，0.5 g/L磷酸溶液;B液，V(乙腈)∶V(0.5 g/L磷酸溶液)=70∶30;C液，V(乙腈)∶V(0.5 g/L磷酸溶液)=90∶10。

C18SPE柱預先用6 mL的乙腈和純水活化。啤酒樣品充分脫氣后，取9 mL脫氣啤酒過SPE-C18小柱。依次用3 mL A液淋洗，3 mL B液淋洗，最后用1.5 mL C液洗脫，洗脫液經0.22 μm濾膜過濾后上機檢測。圖8為最終的啤酒樣品中葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的HPLC譜圖。

葎草靈酮= L1+L2+L3+ L4；希魯酮= X1+X2；異α-酸= T1+C1+T2+C2+T3+C3(T為反式，C為順式)圖8 啤酒樣品中葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的HPLC譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of humuliones, hulupones and iso-α-acids in beer

2.3 方法重現性、檢出限和回收率

重現性：同一啤酒進行6次的樣品前處理和儀器分析，葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的峰面積的相對標準偏差RSD≤4%，重現性較好，滿足實際樣品檢測需求(表2)。

檢出限：以被測組分的3倍信噪比為最小檢出限，該方法中葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的最小檢出限為0.03、0.03和0.05 mg/L。

回收率：由于本方法未分別獲得葎草靈酮和希魯酮的純物質，故將參考標樣浸提液(其中葎草靈酮和希魯酮的含量已知)，以及異α-酸標樣加入啤酒樣品中，分別計算待測物的回收率，見表3。

表2 葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的峰面積重現性Table 2 RSD of humuliones, hulupones and iso-α-acids

表3 葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的回收率Table 3 Spiked recoveries of humuliones, hulupones and iso-α-acids

注：葎草靈酮和希魯酮含量均以異α-酸計。表4同。

2.4 不同品類啤酒中葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的分析

利用本方法檢測市售不同品類的啤酒中葎草靈酮、希魯酮和異α-酸含量，了解不同品類啤酒中主要的苦味物質組成。從表4中數據可以看出，Lager啤酒、皮色森啤酒、小麥啤酒和黑啤酒中，葎草靈酮和希魯酮含量均不高(<2 mg/L)；而在IPA啤酒中，含有較高的葎草靈酮、希魯酮和異α-酸，且不同品牌的苦味物質分布差異較大，這主要是由于IPA啤酒特殊的酒花添加量和添加工藝造成的。IPA啤酒以突出的酒花風味為特點，一方面會使用大量的、不同種類的酒花進行搭配；另一方面，添加工藝也區別于其他品類啤酒，除了正常的酒花煮沸添加工藝(使酒花中的α-酸異構化成苦感較重的異α-酸)以外，還有酒花干加工藝(使酒花中α-酸、葎草靈酮、希魯酮等溶解出來)，從而使得IPA啤酒中的酒花苦味物質更加復雜，這也是近年來葎草靈酮、希魯酮等酒花苦味酸氧化物引起釀酒師們關注的原因。本方法的建立為后續研究這些苦味物質對啤酒苦感的影響提供了技術手段。

表4 市售不同類型的啤酒樣品中苦味物質組成Table 4 The composition of bitter substances in different commercially beers

3 結論

本文建立了啤酒中苦味物質——葎草靈酮、希魯酮和異α-酸的固相萃取(SPE)-高效液相色譜(HPLC)檢測技術。采用易于獲得的高甲酸顆粒酒花作為原料，高溫空氣氧化制得酒花苦味酸氧化物，通過HPLC分離，結合文獻報道的葎草靈酮和希魯酮的紫外光譜特性確定了這2類氧化物的參考標樣，克服了無商業化葎草靈酮和希魯酮標準品帶來的無法定性和定量的困難。同時，對比了不同類型SPE柱對于啤酒樣品中待測組分的富集效果，確定了最佳的樣品前處理條件。該方法簡便易行，可操作性強，滿足對不同品類啤酒中酒花苦味物質組成的分析，特別是對于高酒花添加量的IPA啤酒而言，為進一步研究不同酒花添加工藝帶來的啤酒苦味物質組成差異及其對苦感質量的影響提供有力的檢測手段。