兒童馬方綜合征患者原纖維蛋白1基因突變與臨床表型的相關性研究

孔 煜 李 揚 李玉琳 張曉平 鄭 萍 溫海初 杜 杰

馬方綜合征（Marfan syndrome，MFS）是嚴重遺傳性結締組織病，為常染色體顯性遺傳，發病率在1/3 000～5 000[1-2]，MFS臨床表現不一，主要累及眼睛、骨骼、心血管等器官組織。骨骼系統的主要表現包括身材高大，胸廓畸形，蜘蛛指，脊柱側凸等；眼睛主要表現在高度近視和晶狀體異位；心血管系統主要表現在主動脈根部的擴張以及伴隨的主動脈瘤和主動脈夾層，其他還包括二尖瓣和三尖瓣的脫垂以及鄰近肺動脈的擴張，是MFS患者就醫和死亡的主要原因[3]。目前，MFS的診斷標準主要依據2010年發布的修訂版Ghent標準[4]。

MFS主要由編碼原纖維蛋白1的（fibrillin 1，FBN1）基因突變引起[5]，FBN1基因位于人類第15號染色體，有65個外顯子，迄今已經發現超過3 000種FBN1基因的突變[6]，每個家庭的突變幾乎都是獨特的，突變方式包括無義、移碼、剪接、插入/缺失以及錯義突變[7]，也包括整個基因和多個外顯子的丟失[2]。

基因型和臨床表型的復雜多變[8]，對MFS的臨床決策造成了極大的困難。目前，國人對MFS基因型和表型研究十分有限，基因型和表型的關聯尚不清楚，本研究試圖分析我院兒童MFS患者FBN1基因的突變譜，尋找FBN1基因新的致病位點，發現基因型與臨床表型之間的關聯，為國人中兒童MFS患者的臨床診療提供理論基礎。

資料與方法

1.研究對象 本研究納入了2014年至2016年間，就診于北京安貞醫院的30例臨床確診或疑似MFS的兒童患者（年齡＜18周歲），診斷標準依據2010修訂版Ghent標準[4]。所有的兒童患者都經過專業醫師的評估并且有詳細的臨床信息。本研究通過了北京安貞醫院倫理委員會的審查，所有患者均簽署了知情同意書。所有患者都是漢族人。

2.血液樣本獲取及DNA提取 取兒童MFS患者外周靜脈血2 mL（EDTA抗凝），用QIAamp全血DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit）提取基因組DNA。

3.Ion AmpliSeq NGS Panel目標測序 應用Ion AmpliSeq NGSPanel靶向目標測序技術（賽默飛），對FBN1基因目標區域進行NGS測序。針對FBN1基因用AmpliSeq Panel擴增目的片段，進行磁珠純化、鏈霉素標記測序。將100 pmol文庫與磁珠結合在油包水擴增后，鏈霉素標記目的基因，進行Ion PGM上機測序。

4.生物信息學分析 （1）原始數據的處理：①處理原始數據生成BAM文件（軟件：Torrent Suite）；②BAM文件分類、索引、再分類去除錯誤的SNP（軟件：Genome Analysis Tool Kit、Samtools）。

（2）信息注釋以及過濾篩選：1）信息注釋包括：基因參考序列、染色體和cDNA位置、氨基酸變化以及相關公共數據庫信息。（軟件：ANNOVAR；數據庫：SNP數據庫（dbSNP142），千人基因組，外顯子測序計劃（ESP6500），人類外顯子數據庫（ExAC03），全基因組數據庫（cg60），人類基因突變數據庫（HGMD），以及眾多的功能預測軟件）；2）過濾標準：①在千人基因組，外顯子測序計劃（ESP6500），人類外顯子數據庫（ExAC03）中最小等位基因頻率（MAF）＜0.1%；②破壞性突變包括：移碼突變、插入或缺失、終止突變、剪接突變；③非同義突變：a.M-CAP score＞0.025；b.REVEL score＞0.5；c.6項標準中至少符合5項：SIFT＜0.1，Polyphen2＞0.9，CADD score＞30，GERP＞5，Mutation-Taster=“A”or“D”，and LRT=“D”。

（3）篩選結果分為兩類：已知致病突變和疑似致病突變。

（4）計算患者主動脈根部Z評分：Z評分是一個用來標化數據的統計方法，計算公式是主動脈根徑實測值與平均值的差值（單位為mm）再除以標準差，評分越高代表患者主動脈擴展程度越高。

5.Sanger sequencing驗證 對篩選出的突變合成對應的DNA引物，用PCR法進行擴增，用ABI 3730xl測序儀（美 國Applied Biosystems公司）以Sanger測序法進行測序，測序結果與靶向目標測序的結果進行比對。

6.統計學分析 所有統計分析均使用SPSS軟件完成。應用Shapiro-Wilk檢驗來確定數據是否符合正態分布。符合條件的分類變量以頻數（率）表示，使用χ2檢驗或使用Fisher精確概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.我們對30例兒童先證者進行了基因測序，發現27例兒童患者攜帶致病或者疑似致病的FBN1突變，其中錯義突變19例，截短突變8例，剪接突變3例（表1）。

2.用主動脈Z評分對兒童MFS患者的主動脈直徑量化結果 在主動脈Z評分≥3的患者中，大部分患者攜帶截短或者剪接突變（70.0%），小部分患者攜帶錯義突變（30.0%），在主動脈Z評分＜3的患者中，大部分患者攜帶錯義突變（76.5%），小部分患者攜帶截短或者剪接突變（23.5%）。和主動脈Z評分＜3的兒童患者相比，主動脈Z評分≥3的兒童患者有更多的患者攜帶截短或者剪接突變（70.0%vs.23.5%，P＜0.05），差異有統計學意義，故攜帶截短或者剪接突變的兒童患者主動脈擴張的程度更高（表2）。

表1 27例患者FBN1基因突變類型測序結果

表2 27例患者的主動脈Z評分組間FBN1基因突變類型分布[n（%）]

3.FBN1基因中半胱氨酸相關基因突變與臨床表型關系[9]本研究發現16例攜帶FBN1錯義突變的患者中，按照突變是否和半胱氨酸相關將患者分為兩個亞組，其中一組有8例攜帶半胱氨酸相關FBN1突變，另一組有8例攜帶非半胱氨酸相關FBN1突變，攜帶半胱氨酸相關突變的兒童患者有更容易出現晶狀體異位的趨勢（P=0.119，表3）。

表3 半胱氨酸相關FBN1基因突變與晶狀體異位

討論

自Dietz等[5]第一次發現FBN1基因突變導致MFS已經有20余年，FBN1基因編碼的原纖維蛋白1是一種糖蛋白，廣泛的分布在細胞外基質中，對彈性纖維的形成至關重要，FBN1基因的突變會引起原纖維蛋白1的異常，從而引起MFS的一系列表型。人們對這其中的發病機制進行了深入的研究。有研究認為，FBN1基因突變引起MFS的機制可以用單倍劑量不足和顯性負效應兩種機制來解釋，單倍劑量不足指一個等位基因突變后，另一個等位基因能正常表達，但這只有正常水平50%的蛋白質不足以維持細胞正常的生理功能；顯性負效應指某些蛋白突變后不僅自身無功能，還能抑制或阻斷其他蛋白的作用[3]。近來也有研究發現，MFS和TGP-β信號通路的異常有關[10-12]，在MFS患者中，FBN1基因的突變導致TGP-β配體的釋放失控，上調經典和非經典TGP-β信號通路，從而導致TGP-β靶基因的過度表達，進而導致原纖維蛋白的異常，引發MFS的臨床表型。

人們也對MFS基因型和臨床表型的關聯進行了大量的研究，但是只獲得了為數不多的發現。有研究發現FBN1基因發生半胱氨酸替換與晶狀體異位有關[9]；攜帶截短或者剪接突變的MFS患者更易發生主動脈事件[13]；FBN1單倍劑量不足突變的患者更多地出現了雞胸、硬腦膜擴張、皮紋等表現[14]，并且這些患者有更高的風險出現主動脈事件和心血管相關的死亡[15]；FBN1基因第47號外顯子跳躍突變的MFS患者更容易發生主動脈相關疾病[16]；FBN1基因24-32號外顯子的突變和新生兒MFS或者嚴重的MFS表型相關[17]。

本研究是中國人群中少有的有關兒童MFS患者的研究，我們發現在中國人群中攜帶截短或剪接突變的兒童MFS患者主動脈擴張的程度更高，相比之下攜帶錯義突變的兒童MFS患者主動脈擴張程度較小，這一發現和Baudhuin等[13]的發現，在某種層面上是一致的，他們的結果提示攜帶截短或剪接突變的患者更易出現主動脈事件（主動脈瘤和主動脈夾層）。

本研究也存在局限性，首先，北京安貞醫院是中國最大的MFS診療中心之一，這些兒童患者可能都有比較嚴重的表型；其次，患者人數相對較少，數據可能有所偏倚；再者，很多新報道的突變的判定都是基于生物信息學的分析和相關軟件的預測，缺少對應的功能學實驗；在以后的研究中，我們會做出相應的改進。

總之，主動脈相關的表型仍然是MFS患者最嚴重的臨床表現，本研究發現攜帶截短或剪接突變的兒童MFS患者主動脈擴張的程度更高，這對兒童MFS患者的未來臨床診療具有重要的意義。