糖尿病加重主動脈縮窄小鼠模型心力衰竭的研究

郝文靜 李玉琳 喬博康 張聰聰 杜杰

心力衰竭（heart failure HF，）是由于心臟結構和（或）功能異常，導致心室充盈或射血能力受損的一種復雜綜合征的臨床綜合征[1-2]。盡管藥物治療、外科手術以及介入技術的水平都大大提高，但心力衰竭仍是全球發病率、死亡率很高的疾病。究其原因一方面是由于目前對心力衰竭發病機制的研究還不是十分透徹，另一方面是導致心力衰竭發生的因素多種多樣[3]。心力衰竭也是很多疾病發生發展的終末死亡原因。大規模流行病學研究表明糖尿病會使心血管疾病的危險性顯著上升，不僅會增加心血管疾病的發病率與病死率，也增加了總死亡率[4-5]。然而糖尿病加重心力衰竭的研究尚不完善，本研究通過以自發性2型糖尿病模型dbdb小鼠復制主動脈縮窄模型，旨在觀察糖尿病對心功能衰竭的促進作用研究。

材料與方法

1.材料和主要試劑 雄性7周齡C57BL/6 J小鼠15只，無特定病原體（SPF）級，體質量23～25 g，由華阜康生物科技股份有限公司提供，在首都醫科大學附屬北京安貞醫院實驗動物中心所屬的SPF級動物房飼養。雄性7周齡dbdb糖尿病小鼠15只，無特定病原體（SPF）級，體質量在20～25 g之間，由南京動物研究所提供，在首都醫科大學附屬北京安貞醫院實驗動物中心所屬的SPF級動物房飼養。蘇木素（中國Mayer公司）伊紅（中國Mayer公司）Vivid小動物超聲心動儀（英國GE Healthcare公司）。

2.方法 將實驗動物分為四組。野生型（WT）假手術組（A組），糖尿病模型（dbdb）小鼠假手術組（B組），WT+主動脈縮窄術（TAC）組（C組）；及dbdb老鼠+主動脈縮窄術（TAC）組（D組）。構建兩組小鼠主動脈縮窄術模型：手術器械高壓滅菌，手術臺面依次用乙醇消毒，小鼠經腹腔注射戊巴比妥后，小鼠頸部至劍突、倆側上肢間胸部皮膚經脫毛備皮，小鼠仰臥位，四肢經醫用膠帶固定于手術操作板上，從頸部開一個越3～4 cm的縱行切口，用粗的彎鑷剝開甲狀腺，然后用精細直鑷剝離暴露氣管，沿氣管正中剪開胸骨，在顯微鏡下找到胸腺用精細直鑷分離胸腺暴露主動脈弓后，用針帶線把線穿過主動脈弓并在放置墊針的情況下接扎主動脈弓，撤掉墊針，然后關閉胸腔封皮即可。[6]在主動脈縮窄術（TAC術）后1周，超聲檢測胸主動脈流速水平，流速值平穩于3 000以上，表示小鼠心力衰竭模型建立成功。

3.組織病理切片制備 小鼠在0.1%戊巴比妥鈉麻醉的情況下，使用肝素化0.9%氯化鈉溶液進行心臟灌注，直至將所有血液去除干凈后，剪下小鼠心臟組織，一部分在4%多聚甲醛中固定過夜，然后進行脫水包埋制作石蠟切片。采用Masson法觀察四組小鼠心臟間質中膠原的沉積，采用蘇木精一伊紅（HE）染色法和麥胚凝集素（WGA）染色法檢測四組小鼠心肌細胞肥厚面積。

4.心臟超聲的測定 應用1%的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進行腹腔注射麻醉；用脫毛膏將小鼠胸部的毛發脫去；將小鼠平躺固定；用連接好的探頭對動物開始掃描成像，并保存圖像；將所保存的圖像導入分析軟件中進行分析，將算出的數據進行統計。

5.蛋白質印跡法檢測AKT2的表達 AKT2磷酸化及AKT2蛋白表達，每組各取4只小鼠于主動脈縮窄術（TAC）處理8周后，收取整個心臟組織，加入組織裂解液并用粉碎儀粉碎組織提取組織總蛋白。BCA法測定蛋白質含量。每組取50μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉移到A硝酸纖維素膜上，用5%的BSA封閉液封閉1～2 h，加入一抗（兔抗小鼠p-AKT2、AKT2、為1:1 000，GAPDH單克隆抗體1:1 000），4℃孵育過夜，TBST緩沖液（0.05%Tween20的TBST緩沖液）洗膜10 min×3次，以1:5 000稀釋HRP標記的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，常規洗膜，用Odyssey掃描儀掃膜儀掃描并進行光密度值分析。

6.統計學方法應用GraphPad Prism7.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，四組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.糖尿病模型及心力衰竭模型構建成功 與野生WT組相比糖尿病模型dbdb小鼠組的血糖明顯升高（P＜0.01），表示糖尿病的模型成功，兩組小鼠在主動脈縮窄術后1周主動脈弓部血流的流速值均＞3 000，表示兩組小鼠心力衰竭模型建立成功（圖1）。

2.糖尿病對主動脈縮窄術誘導心力衰竭小鼠的心率和血壓無影響 心率和血壓也是影響心力衰竭的重要因素，A組和B組比較 主動脈縮窄術后0、8周小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均無顯著升高（均P＞0.05），兩組間心率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05，圖2）。

圖1 兩組小鼠的血糖及主動脈縮窄術后主動脈流速變化情況 A：兩組 兩組小鼠的血糖值；B：兩組小鼠術1周后的流速變化

3.糖尿病促進主動脈縮窄術誘導心力衰竭小鼠心功能的惡化 糖尿病dbdb小鼠和對照WT小鼠行主動脈縮窄手術，術后0周、2w、4周、6w、8周超聲監測小鼠的心功能變化顯示，術后4周反映心功能指標的EF明顯降低，D組與C組比較，D組較C組降低更顯著，有統計學意義（P＜0.05）。光鏡下四組小鼠比較，假手術及主動脈縮窄術8周后的小鼠心臟組織切片及HE染色結果表明，HE染色紅色為心肌細胞質，細胞核深藍色，主動脈縮窄術8周后糖尿病（dbdb）小鼠組心臟炎癥浸潤明顯加重。鏡下心臟組織的Masson染色結果比較發現，Masson染色后膠原纖維為藍色，C組和D組小鼠心臟均有表達，但D組心臟組織中膠原增加更明顯，心臟纖維化面積明顯大于C組小鼠[C組vs.D組：（4.07±0.37）%vs.（5.85±0.48）%，（P＜0.05）]，差異有統計學意義；A組與B組比較差異無統計學意義[A組vs.B組：[（0.95±0.13）%vs.（1.03±0.06）%，P＞0.05]，見圖3。

圖2 兩組小鼠主動脈縮窄術0周、8w后心率及血壓的變化 A：兩組小鼠術后心率的變化；B～D：兩組小鼠術后小鼠血壓的變化，注：與對照組相比，均P＞0.05

圖3 兩組小鼠在主動脈縮窄術后小鼠心功能變化情況 A～B：兩組小鼠不同時間點后心臟射血分數及心功能超聲大體圖變化，C：兩組小鼠術后8周進行石蠟切片和HE染色（×200），D～E：兩組小鼠小鼠心臟Masson染色圖以及Masson染色陽性面積 注：與對照組相比，*P＜0.05

圖4 兩組小鼠主動脈縮窄術后心臟肥厚的變化情況 A：兩組小鼠縮窄術不同時間點后心臟舒張末期直徑（LVID，s）的變化，B：兩組小鼠術后心臟體質量比，C：兩組小鼠術后心臟大體圖，D～E：兩組小鼠術后心臟組織切片麥胚凝集素染色結果（×200）以及心肌細胞橫截面積，注：與對照組相比，*P＜0.05

圖5 Western blot檢測P-Akt2及Akt2表達水平 A：野生（wt）組；B：糖尿病（dbdb）小鼠組；C：Western blot條帶灰度分析圖

4.糖尿病促進主動脈縮窄術小鼠的心臟肥厚主動脈縮窄術4周后，心臟肥厚指標左心室收縮末期直徑（LVID，s）明顯升高，D組與C組比較，D組較C組顯著升高，[C組vs.D組：（2.89±0.37）vs.（3.17±0.82），P＜0.05]，有統計學意義。主動脈縮窄術8周后，心臟體質量比D較C組顯著升高[C組vs.D組：（4.37±0.67）vs.（6.12±0.32），P＜0.05]，差異有統計學意義，心臟大體圖比較發現D組較C組明顯增大。WGA染色細胞膜為亮綠色。主動脈縮窄術8周后，D組小鼠心肌細胞面積明顯增大，均大于野生C組小鼠[C組vs.D組：（151±21）vs.（223±17），P＜0.05]，差異有統計學意義；A組與B組比較差異均無統計學意義[A組vs.B組：（103±6）vs.（135±3），P＞0.05]。

5.糖尿病對主動脈縮窄術后心力衰竭小鼠akt2表達的影響以往的研究發現akt2可以調節體內葡萄糖的平衡及其缺失可以誘導心臟肥厚為了考察akt2是否參與了糖尿病對主動脈縮窄術后心力衰竭小鼠的影響作用 我們通過蛋白印記檢測研究表明，主動脈縮窄術0周及8周后，A組與B組比較發現，B組AKT2磷酸化及AKT2總蛋白表達水平較A組顯著降低。

討論

本研究用糖尿病小鼠構建心力衰竭模型，闡明了糖尿病在主動脈縮窄術誘導小鼠心力衰竭中的作用，糖尿病小鼠可以加重心力衰竭小鼠的心功能（降低心臟射血分數等心功能指數），但不影響心力衰竭小鼠的心率及血壓。進一步研究發現糖尿病可以加重心力衰竭小鼠的心臟肥厚、炎癥細胞的浸潤，初步探討其機制可能是由于磷酸化AKT2的下調引起的。

既往有文獻報道糖尿病是心力衰竭的重要危險因素[7]，其所伴發的高血脂、代謝紊亂會對心血管系統造成不同程度的損害，最終導致患者心臟收縮與舒張功能障礙[8]。葡萄糖是心臟的主要能量來源，血糖異常升高對心臟產生重大影響，HbAlc水平每增加1%，心力衰竭的風險增加8%[9-10]心力衰竭的發展也會促進糖尿病的發生發展，故心力衰竭與糖尿病二者相互促進、互為因果，從而加速病情進展。既往研究表明，HF在糖尿病心血管并發癥中發生率及死亡率遠高于心肌梗死、卒中、終末期腎病等嚴重并發癥，且糖尿病患者心力衰竭事件的發生率高于普通患者[11]。合并糖尿病的心力衰竭患者每年住院率比未合并者明顯增加（從24%～31%），同時糖尿病也增加了患者的死亡風險。對于急性心力衰竭入院的患者，合并糖尿病者死亡率高于未合并者，且血糖水平增高增加患者早期死亡率[12]。本研究發現，主動脈縮窄術8周后，dbdb小鼠的心臟射血分數、縮短分數明顯降低，心臟纖維化及炎癥浸潤面積明顯增加，心臟肥厚明顯加重。進一步證明糖尿病對心力衰竭的發生、發展起著不可忽視的作用。其次在糖尿病患者中，糖尿病神經病變是最常見的慢性并發癥之一，其中心臟自主神經病變發生心血管事件的幾率明顯增加，心率主要受自主神經的調節[13]，但在本研究中2型糖尿病（dbdb）小鼠在主動脈縮窄術8周后心率沒有發生明顯變化，此結果可能是由于目前對dbdb小鼠在主動脈縮窄術后心臟自主神經變化的研究尚不完善，因此關于自發性2型糖尿病模型dbdb小鼠復制主動脈縮窄模型對心率的具體影響作用還需進一步研究。

糖尿病發心力衰竭的相關機制包括高血糖與葡萄糖毒性、高血脂與脂毒性、高胰島素血癥和胰島素對心肌的直接作用、線粒體功能異常、細胞間Ca2+穩態異常、腎素-血管緊張素-醛固酮系統的作用等。其中研究最廣泛的是是高血糖和葡萄糖毒性[14]。高血糖情況下可以促進蛋白激酶B（AKT）的活性增強[15]。AKT2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族之一，高表達在胰島素相關組織如脂肪組織、肝、骨骼肌組織，在胰島素反應性組織中高度活化，且在胰島素刺激葡萄糖攝取中起關鍵作用[16]。AKT2可以調節葡萄糖體內平衡并且AKT2缺陷可以導致胰島素抵抗及表現為糖尿病表型。本研究發現在主動脈縮窄術后的dbdb小鼠較WT小鼠的AKT2表達水平下調，這為糖尿病促進小鼠心力衰竭的發生發展提供了新的研究方向。

綜上所述，本研究進一步揭示了糖尿病對心力衰竭過程中心臟結構和功能的作用，為糖尿病和心力衰竭的關系提供了進一步的認識，為臨床治療上提供更多的理論基礎，但是心力衰竭與糖尿病二者相互促進的相關機制仍需進一步探究。