2-甲氧基雌二醇對缺血缺氧誘導的大鼠心肌細胞凋亡的影響

劉紅軍 楊杰

急性心肌梗死治療的關鍵在于盡早溶栓恢復心肌血流灌注[1]，但多項研究發現[2-3]，在心肌恢復血流灌注時，心臟功能非但沒有恢復，心肌損傷反而加重，心肌壞死面積增加。2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）作為雌二醇代謝產物，存在于尿液和血液中，其具有抗腫瘤活性，在抑制腫瘤細胞增殖及微血管生成中發揮重要作用[4]。有研究指出[5-6]，2ME2可抑制缺氧誘導因子-1α（HIP-1α）表達及凋亡相關基因Caspase-3表達而在減輕局灶性腦缺血鼠神經細胞凋亡中發揮重要作用。本研究通過構建大鼠急性心肌梗死模型，觀察2ME2對心臟功能及心肌細胞凋亡的影響。

材料與方法

1.實驗動物 清潔級健康，雄性，成年SD大鼠40只，7～8周齡，體質量（260±20）g，購自河南省實驗動物中心（合格證號：SYXK（豫）2016-0002），飼養于標準環境下，自由進食、進水，適應性飼養7 d。利用隨機數字表隨機分為假手術組、模型組、溶媒組和2ME兩組，每組10只。

2.主要試劑和設備 2ME2和二甲基亞砜由美國Sigma公司提供，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司，兔抗鼠HIP-1α多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗鼠Bcl2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3（Bcl2/adenovirus E1B 19kDa-interacting protein 3，BNIP3）多克隆抗體購自武漢艾美捷科技有限公司，小動物呼吸機購自上海千盛生物科技有限公司，彩色多普勒超聲顯像儀購自德國Siemens公司，凝膠電泳成像分析系統購自美國Bio-Rad公司。

3.構建大鼠急性心肌梗死模型 參照文獻[7]中的方法制備大鼠急性心肌梗死模型：腹腔注射4%水合氯醛將大鼠麻醉，備皮、固定于小動物手術臺，行氣管切開、插管，用小動物呼吸機輔助呼吸，潮氣量18 mg/kg，呼吸頻率70次/min，用手術刀沿胸骨左緣2、3、4肋間縱向切開，鈍性分離胸膜，打開心包膜，使心臟充分暴露。用6-0醫用縫合線穿過左冠狀動脈前降支起始部心肌淺表層，進針深度約1 mm，絲線兩端穿長2 cm的套線圈，同時拉緊兩端絲線使套線圈垂直壓向心臟，將左冠狀動脈前降支血流阻斷，制造心肌缺血，以心電圖示ST段抬高為模型構建成功。30 min后，將套線圈松開，使心肌血流恢復，灌流120 min。假手術組僅使心臟暴露而不結扎左冠狀動脈前降支。建模過程中，模型組和溶媒組各死亡1只大鼠，均進行了補充，保持樣本量不變。2ME兩組在大鼠蘇醒3 h內按24 mg/kg劑量腹腔注射2ME2，溶媒組和模型組則給予等量的二甲基亞砜或0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續7 d。

4.各組大鼠心臟功能檢測 建模后第8天時，腹腔注射4%水合氯醛，待大鼠麻醉后，仰臥位固定，備皮，用彩色多普勒超聲顯像儀分別對大鼠LVEDD和LVESD測量，計算LVEF及短軸收縮率（FS），連續測量3個心動周期取均值。

5.各組大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡情況檢測 于各組大鼠心臟功能檢測完畢后，各組大鼠處死，取心臟，留取梗死區組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，按0.4μm厚切片，脫蠟至水，利用0.1%Triton X-100及0.1%檸檬酸鈉液通透，PBS沖洗3次，血清封閉25 min，PBS沖洗3次，按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明避光孵育60 min，甘油封片，顯微鏡下觀察，以細胞核出現棕黃色或黃褐色染色為陽性，高倍鏡下隨機計數10個高倍視野計算陽性細胞比例。

6.各組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白表達 取各組大鼠心肌梗死區組織，研磨均漿，加入蛋白裂解液，4℃下15 000×g離心10 min，取上清液，按BCA蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白定量。取總蛋白50μg，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉60 min，將一抗兔抗鼠HIP-1α和BNIP3多克隆抗體加入（稀釋比例：1:1 000，1:1 500），4℃條件下過夜孵育，TTBS洗膜3次，加入二抗，室溫下孵育120min，TTBS洗膜3次，暗室下加入電化學發光反應液，反應15 min，拍照，利用Quantity One 4.66圖像分析軟件以GAPDH為內參計算目的蛋白相對表達量。

表1 各組大鼠心臟功能比較（）

表1 各組大鼠心臟功能比較（）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與溶媒組比較，c P＜0.05

組別 數量 LVEDD/mm LVESD/mm LVEF/% FS/%假手術組 10 5.40±1.14 4.05±0.87 86.27±4.61 46.01±5.27模型組 10 10.54±2.50a 9.36±2.12a 51.09±5.53a 26.90±9.27a溶媒組 10 11.80±3.28a 8.66±1.53a 46.45±6.11a 27.46±6.55a 2ME兩組 10 7.78±1.49abc 6.63±0.80abc 63.45±5.21abc 37.28±5.90abc F值 15.993 27.550 109.161 17.233 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 TUNEL法各組大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡情況 A：假手術組；B：模型組；C：溶媒組；D：2ME兩組，TUNEL（×200）

7.統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.各組大鼠心臟功能 四組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF和FS差異有統計學意義（P＜0.05），模型組和溶媒組大鼠LVEDD和LVESD均高于假手術組，而LVEF和FS均低于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05），2ME兩組大鼠LVEDD和LVESD均低于模型組和溶媒組，而LVEF和FS均高于模型組和溶媒組，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

2.各組大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡情況假手術組、模型組、溶媒組和2ME兩組大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡率分別為（3.83±0.83）%、（68.25±6.02）%、（71.29±8.51）%和（37.71±5.68）%，差異有統計學意義（F=280.515，P=0.000）；模型組和溶媒組大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡率均高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05），2ME兩組大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡率低于模型組和溶媒組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

3.各組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白表達 模型組和溶媒組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白相對表達量高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05），2ME兩組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白相對表達量低于模型組和溶媒組，差異有統計學意義（P＜0.05，表2，圖2）。

表2 各組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白表達（）

表2 各組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白表達（）

組別 數量 HIP-1α蛋白 BNIP3蛋白假手術組 10 0.21±0.07 0.36±0.06模型組 10 0.79±0.13 0.85±0.07溶媒組 10 0.75±0.04 0.83±0.06 2ME兩組 10 0.56±0.05 0.62±0.07 F值 113.215 118.375 P值 0.000 0.000

圖2 Western blot法檢測各組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白表達

討論

近年來，急性心肌梗死發病率呈逐年升高的趨勢[8]，已成為威脅社會及人群生命安全的重大公共衛生問題。目前，隨著早期藥物溶栓、冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路移植術等治療方法的應用，在緩解患者癥狀及改善預后中發揮了積極的作用[9]，但在治療過程中部分患者不可避免的發生了缺血-再灌注損傷，反而加重心肌損傷[10]。心肌缺血-再灌注損傷發生機制較為復雜，其中，心肌細胞凋亡與心肌缺血-再灌注損傷密切相關。因此，積極探討缺血-再灌注損傷中心肌細胞凋亡相關機制，對減輕損傷改善預后意義重大。本研究利用結扎冠狀動脈的方法構建大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，結果顯示，模型組和溶媒組大鼠LVEDD和LVESD均高于假手術組，而LVEF和FS均低于假手術組，同時，模型組和溶媒組大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡率均高于假手術組，說明相比于假手術組，模型組和溶媒組心臟功能降低，且心臟梗死區心肌細胞凋亡率升高，提示成功制備了模型。

在正常生理條件下，HIP-1α半衰期比較短，經羥化、泛素化修飾等降解，低水平存在于細胞內[11]，而在缺血缺氧環境下，由于羥化酶活性降低，會誘導HIP-1α大量表達而蓄積于細胞內，通過作用于其靶基因BNIP3蛋白而介導細胞凋亡[12]。有研究指出[13]，BNIP3是缺血再灌注損傷心肌細胞死亡所必需的。2ME2作為雌激素小分子代謝產物，可通過抑制HIP-1α及血管內皮生長因子（VEGF）表達，一方面可減少血管增生，另一方面又可通過抑制HIP-1α及其下游靶基因BNIP3表達而減少細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，2ME兩組大鼠LVEDD和LVESD均低于模型組和溶媒組，而LVEF和FS均高于模型組和溶媒組，說明2ME2可改善缺血-再灌注損傷大鼠心臟功能，同時，本研究結果顯示，2ME兩組大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡率低于模型組和溶媒組，說明2ME2可有效減少心臟梗死區心肌細胞凋亡率，具有心肌保護作用。本研究結果顯示，模型組和溶媒組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白相對表達量高于假手術組，說明HIP-1α和BNIP3可能參與了大鼠心臟梗死區心肌細胞凋亡，而2ME兩組大鼠心臟梗死區心肌組織中HIP-1α和BNIP3蛋白相對表達量低于假手術組，說明2ME2可能通過抑制HIP-1α及其靶基因BNIP3蛋白而減少心肌細胞凋亡。

綜上所述，2ME2可減少缺血-再灌注損傷大鼠梗死區心肌細胞凋亡，改善心臟功能，其機制可能與抑制HIP-1α及其靶基因BNIP3表達有關。