去卵巢和雌二醇預防性治療影響大鼠甲狀旁腺中PTH基因及其關鍵調控因子的mRNA表達

李游山 張婷婷 朱瑞 馮自立 白瑜

1. 陜西理工大學維生素D生理與應用研究所，陜西 漢中 723001 2. 陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001 3. 陜西理工大學心理健康教育中心，陜西 漢中 723001

雌激素缺乏通常被認為是導致絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的主要原因。在小鼠模型中，腹腔注射雌激素-RGD肽偶聯物，可降低血清鈣和堿性磷酸酶的濃度，提高小鼠股骨中鈣、磷和礦物質的水平[1]。筆者近期的研究結果表明，對大鼠預防性注射適量的β-雌二醇(β-estradiol，E2)后能夠較好的防治去卵巢導致的骨質疏松癥，而且不會引起子宮等組織的病變[2]。已有研究[3-5]表明，甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)在機體骨轉換中發揮著重要作用，可以顯著改善PMOP婦女腰椎、全髖關節、股骨頸的骨密度。PTH的表達和分泌可能受Ca2+濃度、鈣敏感受體CaSR(calcium-sensing receptor)、成纖維細胞生長因子FGF-23(fibroblast growth factor-23)、FGF-23受體FGFR1(fibroblast growth factor receptor 1)及其輔助受體Klotho等因素的影響[6-9]。

雌激素和PTH在PMOP發生和發展中可能存在著某種聯系，但人們對雌激素和PTH在PMOP發生、發展過程中的作用及調控關系的認識還十分有限，迄今為止尚缺乏雌激素直接調控PTH表達的證據。正常狀態下的甲狀旁腺細胞中是否存在雌激素受體、雌激素與影響PTH表達的潛在調控因素之間存在怎樣的聯系，這些問題都亟待解答。

鑒于此，本研究利用去卵巢大鼠骨質疏松模型，分析去卵巢和雌二醇預防性治療對大鼠PTH表達的影響，初步探索甲狀旁腺中的ER-α、Ca2+/CaSR以及FGF-23/Klotho受體調控系統中關鍵基因的表達變化，為女性絕經后骨質疏松癥的預防和治療提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試大鼠和試劑耗材

7周齡SD雌性大鼠(SPF級)購自第四軍醫大學實驗動物中心，實驗動物質量合格證號為0032811，許可證號為SCXK-(軍)2012-0007。大鼠由人工飼料喂養，飼養條件為：動物房通風良好，12 h光照/12 h黑暗，相對濕度45%～55%，自由進食和飲水。β-雌二醇購自北京索萊寶科技有限公司；TRI Reagent購自Sigma-Aldrich(St Louis，MO，USA)公司；反轉錄試劑盒購自Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)公司；SYBR? Select Master Mix購自Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)公司；引物由華大科技(中國深圳)公司合成。

1.2 方法

1.2.1造模、給藥及組織樣品采集：參照筆者先前報道[2]的方法構建絕經后骨質疏松大鼠模型和實施雌二醇預防性治療。將18只飼育至3月齡的SD雌性大鼠隨機分為以下3組：去卵巢組(ovariectomized，OVX)、β-雌二醇預防性給藥組(β-estradiol treated OVX，OVX/E2)、假手術組(sham-operated，Sham)。經背側部雙切口入路切除OVX組和OVX/E2組大鼠的雙側卵巢，摘除Sham組大鼠卵巢周圍少許脂肪。術后前3天，每日給大鼠肌肉注射0.2 mL青霉素 G 鈉(50 mg/mL)，同時用頭孢曲松鈉溶液(50 mg/mL)沖洗創面。自術后第10 天開始，按照10 μg(kg·bw)劑量對OVX/E2組大鼠皮下注射β-雌二醇，每日1次。對于OVX和Sham組中的大鼠，則皮下注射等量的溶劑[含有0.01%(v/v)DMSO的生理鹽水]。連續給藥51 d后，處死大鼠，采集血液、甲狀旁腺、股骨和脛骨。將血液樣品于室溫下斜面靜置1 h，然后4 ℃靜置過夜，使血清自然析出，于4 ℃、 4 000 r/min, 離心10 min，收集上方血清，置于-80 ℃冰箱保存備用。將甲狀旁腺組織用液氮冷凍處理后，置于-80 ℃冰箱保存備用。首先將不同處理組大鼠的骨組織置于4%的多聚甲醛中，4 ℃固定24 h, 接著依次用25%、50%、75%的乙醇進行梯度脫水，最后置于75%的乙醇中保存。

1.2.2股骨、脛骨的組織形態學觀察：首先將固定后的股骨和脛骨轉移至10%的EDTA溶液(pH 8.0)中，4 ℃脫鈣20 d。接著依次用75%、80%、95%、100%的乙醇進行組織脫水，然后開展二甲苯透明、石蠟包埋、組織切片和H&E染色，最后于光學顯微鏡下觀察股骨和脛骨的形態結構。

1.2.3血清雌激素的測定：參照大鼠雌激素酶聯免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司)的使用說明書，準備不同濃度(0、2、4、8、16、32、48 ng/L)的標準樣品和5倍稀釋后的待測血清樣品。取50 μL樣品至包被有抗體的96孔板中，37 ℃孵育30 min。空白對照孔中則加入50 μL樣品稀釋液。然后依次進行洗滌，酶標試劑孵育、洗滌、顯色和終止顯色反應，最后利用BioTek Epoch全波長酶標儀在450 nm處進行檢測，以空白對照調零，計算不同處理組的大鼠血清中的雌激素含量。

1.2.4血清鈣含量測定：參照微孔板法鈣試劑盒(南京建成生物工程研宄所)的使用說明書，以梯度稀釋法配制不同濃度的標準樣品。分別取10 μL不同濃度的標準樣品和2.5倍稀釋后的待測血清樣品至96孔板中，以等體積的ddH2O作為空白對照。接著加入250 μL工作液，靜置5 min后測定610 nm處各孔的吸光值，進而計算血清鈣的含量。

1.2.5實時定量PCR：參照廠家提供的使用說明書，利用TRIzol試劑提取不同處理組的大鼠甲狀旁腺的總RNA。對RNA溶液進行吸光度檢測和RNA凝膠電泳，以保證總RNA的質量。利用M-MLV反轉錄酶將0.6 μg RNA反轉錄成cDNA。基于NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用Primer Premier 5.0軟件設計大鼠GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， 3-磷酸甘油醛脫氫酶)、PTH、ER-α、CaSR、FGF-23、FGFR1、Klotho和Egr1(early growth response gene 1，早期生長反應基因1)的定量引物(表1)。以大鼠GAPDH基因作為內參基因。以不同處理組的大鼠甲狀旁腺cDNA為模板，利用Step One PlusTMPCR儀(Applied Biosystems)進行實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)檢測。反應體系為：SYBR Green預混液10 μL，正向引物(4 μmol/L)1 μL，反向引物(4 μmol/L)1 μL，cDNA模板1 μL，滅菌水7 μL。擴增程序為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。用2-△△Ct法計算靶基因mRNA的相對表達量[10]。

表1 qPCR反應引物Table 1 Primers for qPCR

1.3 統計學分析

利用SPSS 20.0軟件的對數據進行單因素組間方差分析，評估各組間的統計學意義。*P<0.05，**P<0.01，nsP>0.05。其中血清雌激素和血清鈣測定實驗中n=6，qPCR實驗中n=3。

2 結果與分析

2.1 去卵巢和雌二醇預防性治療對大鼠股骨和脛骨組織形態的影響

圖1 不同處理組大鼠股骨和脛骨的組織形態Fig.1 The histological morphology of femur and tibia in different treated rats注：BM：骨髓腔；TB：骨小梁

探討雌激素和PTH在絕經后骨質疏松癥發生和發展中的內在聯系，首先需對供試大鼠進行雙側卵巢摘除手術，并于術后適時進行一定劑量的β-雌二醇預防性治療。為了分析去卵巢和雌二醇預防性治療對大鼠股骨和脛骨組織形態的影響，筆者利用石蠟切片HE染色法對各處理組大鼠的股骨和脛骨進行組織形態學觀察。結果顯示(圖1)，相比較于Sham組，OVX組大鼠的股骨和脛骨均出現骨小梁斷裂、間距變大、結構紊亂等骨質疏松癥狀，而OVX/E2組大鼠并未出現明顯的病理癥狀。這表明摘除卵巢后引起的卵巢功能缺失可導致大鼠絕經后早期骨質疏松形成，而一定劑量的雌二醇預防性治療能夠較好的預防骨質疏松癥的發生。

2.2 去卵巢和雌二醇預防性治療對大鼠PTH的 mRNA水平的影響

為了探討去卵巢和雌二醇預防性治療對大鼠PTH基因表達的影響，筆者利用qPCR對不同處理組的大鼠甲狀旁腺中PTH的mRNA表達量進行分析。如圖2所示，摘除卵巢后大鼠PTH的mRNA表達量顯著降低，而預防性注射一定劑量的β-雌二醇能夠顯著提高PTH的mRNA表達量，提示PTH含量不足與絕經后骨質疏松癥的發生存在著一定的聯系。

圖2 不同處理組大鼠甲狀旁腺中PTH基因的表達變化(n=3；*P<0.05；**P<0.01)Fig.2 Changes of PTH gene expression in parathyroid gland of rats in different treatment groups(n=3;*P<0.05;**P<0.01)

2.3 不同處理組中大鼠血清雌激素和甲狀旁腺中ER-α的表達變化

為了探討不同處理組間大鼠PTH基因的表達變化是否與血清雌激素含量變化有關，筆者利用ELISA技術分析去卵巢和雌二醇預防性治療對大鼠血清中雌激素含量的影響。如圖3A所示，血清雌激素含量在各處理大鼠之間均無顯著性差異，在供試時間范圍內摘除卵巢并未引起血清雌激素含量的明顯降低，雌二醇給藥也沒有引起血清雌激素水平的顯著升高。

為了進一步分析大鼠甲狀旁腺中有無雌激素受體ER-α，去卵巢和雌二醇預防性給藥能否影響ER-α的表達，筆者利用qPCR技術對ER-α在不同處理大鼠甲狀旁腺中表達情況進行分析(圖3B)。與Sham組相比，摘除卵巢可在一定程度上提高大鼠甲狀旁腺中的ER-α mRNA的表達量，而β-雌二醇預防性給藥能夠顯著降低大鼠甲狀旁腺中的ER-α mRNA表達量，提示甲狀旁腺中的ER-α可能介導雌激素對PTH基因的表達調控。

圖3 不同處理組中大鼠血清雌激素和甲狀旁腺中ER-α的表達變化 A：去卵巢和雌二醇預防性治療大鼠血清雌激素水平的影響(n=6);B：不同處理組大鼠的甲狀旁腺中ER-α mRNA表達分析(n=3)；*P< 0.05；**P< 0.01；“ns”表示無統計學意義。Fig.3 Changes of serum estrogen and ER- α expression in parathyroid glands of rats in different treatment groupsA: Effects of ovariectomy and prophylactic estrogen therapy on serum estradiol levels of rats (n=6);B: ER- α mRNA expression in parathyroid gland of rat in different treatment groups (n=3);*P< 0.05;**P< 0.01; “ns” means no significant difference.

2.4 去卵巢和雌二醇預防性治療對甲狀旁腺中Ca2+/CaSR的影響

已有研究[11-13]表明，甲狀旁腺細胞能夠通過細胞膜上的CaSR感知胞外Ca2+的微小變化，及時調節PTH的表達和分泌。為了研究去卵巢和雌二醇預防性治療對甲狀旁腺中Ca2+/CaSR調控系統的影響，筆者分析了不同處理組中大鼠的血鈣濃度和甲狀旁腺中CaSR的mRNA水平。如圖4A所示，發現OVX/E2組大鼠的血鈣水平顯著高于Sham組，但是Sham組與OVX組、OVX組與OVX/E2組之間的差異均無統計學意義。qPCR結果顯示，大鼠甲狀旁腺中CaSR mRNA的表達量在摘除卵巢后顯著降低，而在雌二醇預防性給藥后顯著上調(圖4B)。

圖4 不同處理組間大鼠血清鈣(A)和甲狀旁腺中CaSR表達(B)的變化(n=3;*P<0.05；**P< 0.01;“ns”表示差異無統計學意義)Fig.4 Changes of serum Ca(A) and CaSR expression in parathyroid glands(B) of rats in different treatment groups(n=3;*P< 0.05;**P< 0.01; “ns” means no significant difference)

2.5 去卵巢和雌二醇預防性治療對甲狀旁腺中FGF-23/Klotho受體調控系統的影響

前人研究[9]表明，Klotho是FGF-23的輔助受體，甲狀旁腺中的FGFR1/Klotho受體系統及MAPK途徑能夠介導FGF-23對PTH基因表達的抑制作用。為了研究去卵巢和雌二醇預防性治療對大鼠甲狀旁腺中FGF-23-Klotho受體調控系統的影響，筆者利用qPCR技術分析該調控系統中的關鍵因子FGF-23、FGFR1、Klotho和Egr1表達量。結果顯示，摘除卵巢能夠顯著降低甲狀旁腺中FGF-23、FGFR1和Klotho的mRNA表達量，而雌二醇預防性治療可以顯著提高FGFR1 的mRNA表達量，卻進一步下調FGF-23和Klotho的mRNA表達(圖5A～C)。對MAPK途徑的標記基因Egr1的進一步分析顯示，甲狀旁腺中Egr1 mRNA的表達量在不同處理組間存在顯著性差異。OVX組Egr1的mRNA表達量顯著低于Sham組，卻顯著高于OVX/E2組(圖5D)。上述結果表明，摘除大鼠雙側卵巢可能會降低甲狀旁腺中FGF-23-Klotho系統對PTH表達的抑制作用，而雌二醇預防性治療可進一步降低該受體調控系統的對PTH的調控作用。

圖5 不同處理組大鼠的甲狀旁腺中FGF-23(A)、FGFR1(B)、Klotho(C)和Egr1(D)的表達分析(n=3;*P<0.05；**P< 0.01;“ns”表示差異無統計學意義)Fig.5 Expression of FGF-23(A), FGFR1(B), Klotho(C) and Egr1(D) in parathyroid glands of rats in different treatment groups(n=3;*P< 0.05;**P< 0.01; “ns” means no significant difference)

3 討論

前期研究認為，卵巢功能衰退造成的雌激素分泌不足是引發女性絕經后骨質疏松癥的重要原因。因此，通過切除大鼠雙側卵巢來降低血清雌激素水平被視為建立絕經后骨質疏松動物模型的有效途徑之一。然而，筆者的研究發現Sham、OVX、OVX/E2組大鼠的血清雌激素含量之間沒有顯著性差異，摘除卵巢并未引起大鼠血清雌激素水平顯著降低，雌二醇預防性治療也未能顯著提高血清雌激素水平，這可能與術后時間較短，腎上腺皮質應激性的合成雌激素有關。沈耿楊等[14]對去卵巢后不同時期的大鼠骨量、骨轉換指標、雌激素水平的變化規律進行分析，結果發現在術后12周內大鼠血清中雌激素呈先升高后降低的變化趨勢，去卵巢4周后，OVX組股骨骨礦含量和骨密度均較Sham顯著降低，但其血清雌激素含量與Sham組之間并無顯著性差異，這與此次研究結果基本一致。另有研究[15]表明，低劑量的β-雌二醇給藥能夠部分抵償雌激素的應激性合成，且較小劑量的雌激素給藥既能產生較強的抵償效應。此次研究結果表明，雌激素預防性治療并為引起血清雌激素水平的顯著升高，這可能與雌二醇給藥的引起的雌激素抵償效應有關。在供試時間內，相較于Sham組大鼠而言，OVX大鼠的雌激素水平并未顯著降低，但其股骨和脛骨組織中均出現典型的骨質疏松癥狀，提示女性絕經早期出現的骨質疏松癥可能并非由雌激素水平分泌不足導致，卵巢摘除引起的卵巢整體功能減退可能是OVX大鼠早期骨質疏松癥發生的主要原因，其具體機制仍需進一步探討。

組織和細胞中是否存在ER決定著其能否響應雌激素作用，雌激素受體ERβ1和ERβ2廣泛分布于卵巢、子宮、空腸、甲狀腺、腎皮質、骨髓間質和梁小骨等組織器官中[16]。研究[17-18]表明，雌激素能夠通過骨中的雌激素受體(ER)來阻斷 PKA途徑，進而抑制 PTH誘導的破骨細胞的形成。有研究[19]證實雌激素受體ERβ1和ERβ2廣泛表達于甲狀旁腺腫瘤中，ERβ1激活可引發甲狀旁腺相關基因CaSR、VDR、JUN、CALR和ORAI2等基因的轉錄水平變化，提示甲狀旁腺功能的實現與雌激素信號傳導密切相關。迄今為止，正常大鼠甲狀旁腺中是否存在雌激素受體尚不完全清楚。筆者的研究發現，大鼠甲狀旁腺中存在ER-α，去卵巢和雌二醇預防性治療可改變大鼠甲狀旁腺中ER-α基因的表達量，調節局部雌激素信號轉導，進而影響PTH的表達和分泌。

CaSR屬于G蛋白偶聯受體第三超家族，其在機體Ca2+穩態中起重要的作用。研究[11-12]發現，甲狀旁腺細胞能夠通過細胞膜上的CaSR能夠使感知胞外Ca2+的信號變化，及時調節PTH的表達和分泌。細胞外Ca2+水平降低會導致甲狀旁腺中CaSR的活化減少和PTH的釋放增加，反之則會增加CaSR的活化，抑制PTH的表達[6]。筆者的研究發現，盡管OVX組大鼠股骨和脛骨發生了骨質疏松，但OVX組大鼠血清Ca2+水平相較于Sham組略有升高，兩組之間差異并無統計學意義，這與謝肇等[20]的研究結果是一致的。有研究[14, 20-21]顯示，摘除卵巢后大鼠骨量先快速降低，然后緩慢回升，而血清鈣濃度表現為先升后降的變化趨勢。卵巢摘除導致甲狀旁腺中PTH和CaSR的表達量降低，預防性注射β-雌二醇則引起PTH和CaSR表達量升高，提示CaSR受體可能參與調節PTH的表達，但具體機制尚不明確。

在正常機體中，FGF-23是通過其受體FGFR1/Klotho降低PTH的表達，增加CaSR和VDR的表達量[22]。有研究[23]報道，慢性腎病患者血液中FGF-23水平的增加，并不能降低PTH的表達量，原因是FGFR1/Klotho受體復合物下調，引起甲狀旁腺細胞對FGF-23的抵抗。本次研究發現去卵巢后 FGF-23、FGFR1、Klotho及MAPK途徑的標志物Egr1表達量顯著下調，雌二醇預防性治療后FGF-23、Klotho和Egr1的表達量進一步降低，說明去卵巢后的FGF-23/Klotho受體調控系統抑制PTH表達的能力降低，并且短期內預防性注射β-雌二醇后其抑制PTH表達的能力繼續降低。

本次研究發現去卵巢和雌二醇預防性治療會影響PTH基因的表達，雌激素受體ER-α、Ca2+/CaSR調控系統以及FGF-23-Klotho受體調控系統均可能參與PTH的基因表達調控。需要指出的是，機體PTH的表達調控是一個復雜的過程，不排除去卵巢和雌二醇預防性治療通過改變其他調節因子的水平而影響PTH的表達分泌。該研究不僅有助于闡明雌激素和PTH在絕經后骨質疏松癥發生和發展中的調控關系，而且對女性絕經后骨質疏松癥的預防和治療也具有一定的指導意義。