分子標(biāo)記輔助選育抗褐飛虱和抗稻瘟病的水稻恢復(fù)系

李孝瓊，陳 穎，韋 宇，郭嗣斌

(廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】稻褐飛虱和稻瘟病是嚴(yán)重影響水稻生產(chǎn)的兩大病蟲(chóng)害。褐飛虱具有生長(zhǎng)周期短、繁殖力強(qiáng)、易遷飛等生活習(xí)性，主要通過(guò)刺吸危害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致大面積“冒穿”，造成水稻減產(chǎn)和絕收[1]；此外，褐飛虱還通過(guò)傳播狀叢矮病毒和齒葉矮縮病毒等[2]，給水稻生產(chǎn)帶來(lái)?yè)p失。稻瘟病(Rice blast disease)是由子囊菌[Magnaporthegrisea(Hebert) Barrnov.]引發(fā)的真菌性病害，在全球80多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生，在我國(guó)造成的稻谷年損失量嚴(yán)重時(shí)高達(dá)1×109kg[3]。降低水稻病蟲(chóng)害最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的策略就是發(fā)掘鑒定出廣譜持久高抗的基因，并在此基礎(chǔ)上培育和推廣高抗病蟲(chóng)害的品種。然而，常規(guī)抗病蟲(chóng)育種方法容易受環(huán)境因素的影響，對(duì)表型選擇不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致育種效率低。分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular Marker-assisted Selection, MAS)育種不受外界因素影響，利用與目標(biāo)基因緊密連鎖(或基因內(nèi))的標(biāo)記，對(duì)目標(biāo)單株進(jìn)行標(biāo)記基因型鑒定，結(jié)合農(nóng)藝性狀進(jìn)行篩選，可以有效提高育種效率、縮短育種周期，常用于連續(xù)回交育種對(duì)受體的目標(biāo)性狀進(jìn)行定向改良，是現(xiàn)代分子育種的重要手段[4]。利用MAS技術(shù)聚合高抗褐飛虱和稻瘟病的基因，培育新的多抗品種，對(duì)水稻生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的水稻抗褐飛虱基因被定位克隆，至今已有35個(gè)抗褐飛虱基因被鑒定，其中66.6 %的基因分布在第4號(hào)和第12號(hào)染色體上，29個(gè)基因被定位于水稻7條染色體的不同區(qū)域。目前，已經(jīng)被克隆的褐飛虱抗性基因有位于水稻第4號(hào)染色體上的Bph3[5]和Bph6[6]、位于第12號(hào)染色體上的Bph9[7]、位于第3號(hào)染色體長(zhǎng)臂端的Bph14[8]、位于第12號(hào)染色體長(zhǎng)臂的Bph18[9]和Bph26[10]以及位于第6號(hào)染色體的Bph29[11]、Bph32[12]和Bphi008a[13]。抗稻瘟病基因的研究也取得了較大進(jìn)展，已經(jīng)被鑒定和定位的抗稻瘟病基因超100個(gè)，這些基因成簇分布，大部分基因分布于第6、11和12號(hào)染色體上，少數(shù)基因分布在除第3和11號(hào)染色體外的其他染色體上。在定位的主效基因中，Pi1[14]、Pi2[15]、Pi9[16]、Pigm[17]、Pid3[18]、Pizt[15]、Pi56[19]、Pia[20]、Pib[21]、Pita[22]等26個(gè)抗稻瘟病基因已被成功克隆，并廣泛應(yīng)用于抗病育種中?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前市場(chǎng)推廣的主要水稻品種中，抗褐飛虱的品種為數(shù)不多，聚合抗褐飛虱和抗稻瘟病基因的品種更少，培育的品種大多為單基因抗性品種，專(zhuān)一性較強(qiáng)，難以滿足生產(chǎn)需求。為了防范單基因抗病蟲(chóng)害品種大面積、長(zhǎng)時(shí)間種植后出現(xiàn)抗性喪失問(wèn)題，有必要進(jìn)一步拓寬抗病蟲(chóng)基因的材料基礎(chǔ)，鑒定克隆出抗譜不同的抗病蟲(chóng)基因[23]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)雜交、回交和自交，結(jié)合MAS技術(shù)和抗病蟲(chóng)性鑒定，將Pi9導(dǎo)入本身含有褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的優(yōu)異恢復(fù)系桂恢1561中，從中選育出聚合Bph14、Bph15和Pi9基因的既抗褐飛虱又抗稻瘟病的優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系中間材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

輪回親本為含Bph14和Bph15雙抗褐飛虱純合基因的恢復(fù)系材料桂恢1561(來(lái)源于以IR24 為受體親本的小粒野生稻基因?qū)胂?，由本研究組自主選育完成)[24]；抗病供體親本為恢復(fù)系材料桂99+Pi9(來(lái)源于桂99/IR75-1-172，由湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)院戚華雄老師提供)；稻褐飛虱感蟲(chóng)對(duì)照TN1，抗蟲(chóng)對(duì)照RH，抗蟲(chóng)鑒定的稻褐飛虱捕捉于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所的試驗(yàn)田中，于玻璃溫室中培養(yǎng)約3個(gè)世代作為接種蟲(chóng)源。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因聚合育種流程 以抗褐飛虱恢復(fù)系桂恢1561為輪回親本，桂99+Pi9為父本進(jìn)行雜交、2次回交及2次自交；從BC1F1世代開(kāi)始對(duì)回交后代進(jìn)行MAS，從分離群體中選出含抗稻瘟病基因Pi9的植株繼續(xù)與輪回親本進(jìn)行回交；自交2次后選擇Bph14、Bph15和Pi93個(gè)抗性基因都純合、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系用于褐飛虱苗期抗性鑒定及稻瘟病田間自然誘發(fā)抗性鑒定(圖1)。

1.2.2 分子標(biāo)記 所篩選的與褐飛虱抗性基因Bph14、Bph15緊密連鎖的多態(tài)性分子標(biāo)記分別為MRG2329和MS5[25]，稻瘟病抗性基因Pi9的特異性標(biāo)記為M-Pi9[26]。3對(duì)引物均為共顯性標(biāo)記，由華大基因合成。由于本研究中所用的輪回親本為抗蟲(chóng)親本桂恢1561，所以在回交選育的過(guò)程中沒(méi)有對(duì)抗蟲(chóng)基因Bph14和Bph15進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)，標(biāo)記MRG2329、MS5用于BC2F2群體中檢測(cè)選擇Bph14、Bph15基因純合單株。

圖1 MAS改良桂恢1561抗性技術(shù)路線Fig.1 The technical approach of improving blast resistance of Guihui1561 by MAS

表1 水稻苗期褐飛虱抗性鑒定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Evaluation standard of screening resistant varieties to rice brown planthopper

抗性級(jí)別Resistance grade description死苗率(%)Death rate抗性水平Resistance0≤1.0免疫11.0～10.0高抗310.0～30.0抗530.0～50.0中抗750.0～70.0中感9≥70.0感

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 采用改良CTAB法提取水稻幼嫩葉片DNA。PCR反應(yīng)總體積為15 μl，其中DNA 模板2 μl，2×TaqPCR Master Mix 6 μl，10 nmol/L 的正反向引物各0.5 μl，加ddH2O補(bǔ)足15 μl。引物MS5的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)條件為94 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸45 s，循環(huán)結(jié)束后再72 ℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后體系于4 ℃保存；引物MRG2329和M-Pi9的PCR反應(yīng)程序退火溫度為58 ℃，其他條件與MS5相同。MRG2329和MS5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為8 %的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，銀染，保鮮膜包膠保存并記錄結(jié)果。在M-Pi9的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入核酸染料，用濃度為2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并記錄結(jié)果。

1.2.4 褐飛虱苗期抗性鑒定 采用苗期集團(tuán)法進(jìn)行褐飛虱抗性鑒定，在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行。試驗(yàn)材料為桂恢1561、桂99+Pi9、RH、TN1以及改良恢復(fù)系BC2F3的GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18株系。種子浸種催芽后，播于塑料方盆(52 cm×35 cm×8 cm)中，每個(gè)秧盤(pán)中間播抗感對(duì)照RH和TN1，每盤(pán)播4個(gè)材料，每個(gè)材料播3行，每行25粒，設(shè)2次重復(fù)。當(dāng)秧苗長(zhǎng)到二葉一心時(shí)，剔除弱苗和死苗，按5頭/株的蟲(chóng)量接入2～3齡的褐飛虱若蟲(chóng)，在感蟲(chóng)對(duì)照品種TN1死苗率達(dá)到95 %時(shí)，統(tǒng)計(jì)各株系的死苗率及抗性級(jí)別(表1)。

1.2.5 稻瘟病自然誘發(fā)抗性鑒定 自然誘發(fā)病圃設(shè)在稻瘟病多發(fā)區(qū)廣西岑溪市梨木鎮(zhèn)高圍村，面積約0.7 hm2。病圃常年處于高溫、高濕的氣候環(huán)境中，具有利于發(fā)病的地理環(huán)境條件，歷年稻瘟病發(fā)生嚴(yán)重。病圃全生育期不噴殺菌劑，殺蟲(chóng)劑的使用量根據(jù)病圃蟲(chóng)害發(fā)生的程度而定。共進(jìn)行2次病情調(diào)查：移栽前的苗葉瘟調(diào)查和黃熟期的穗頸瘟調(diào)查。苗葉瘟調(diào)查在每個(gè)株系的發(fā)病中心選擇有代表性的病叢，以發(fā)病最重的20～50張葉片平均發(fā)病等級(jí)作為該株系的抗性級(jí)別；穗頸瘟調(diào)查每小區(qū)至少100穗。田間的栽培管理、調(diào)查方法、病級(jí)劃分、記載標(biāo)準(zhǔn)和抗性評(píng)價(jià)按顏群等[27]的水稻品種試驗(yàn)抗性鑒定方法與標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行?？剐跃C合指數(shù)=苗葉瘟病級(jí)×25 %+穗頸瘟發(fā)病率病級(jí)×25 %+穗頸瘟損失率病級(jí)×50 %。

1.2.6 農(nóng)藝性狀考察 2018年2月下旬播種，3月下旬移栽，于大田種植試驗(yàn)材料，每個(gè)材料種植2行，每行10株，正常水肥管理，于成熟期進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察。每個(gè)材料選擇中間8株，考察性狀，主要包括株高、生育期、單株有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率及千粒重等，取平均值為其表型值。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間的多態(tài)性檢測(cè)

由圖2可知，MRG2329在桂恢1561中擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段較大，在桂99+Pi9中擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段較??；MS5和M-Pi9的產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果與MRG2329相同。3對(duì)引物的PCR產(chǎn)物均在親本間有明顯多態(tài)性，可用于該育種群體各世代中的分子標(biāo)記檢測(cè)。

A-M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、3：抗蟲(chóng)親本桂恢1561；2、4：感蟲(chóng)親本桂99+Pi9；B-M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：抗病親本桂99+Pi9；2：感病親本桂恢1561A-M: DNA Marker; 1, 3: Resistance parent Guihui1561; 2, 4: Susceptible parent Gui99+Pi9; B-M: DNA Marker 1: Resistant parent Gui99+Pi9; 2: Susceptible parent Guihui1561圖2 引物MRG2329、MS5和M-Pi9在親本間的多態(tài)性鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of polymorphism among parents using primers MRG2329, MS5 and M-Pi9

M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：抗病親本桂99+Pi9；2：感病親本桂恢1561；3～12：BC1F1單株M: DNA Marker 1: Resistant parent Gui99+Pi9; 2: Susceptible parent Guihui1561; 3-12: BC1F1 population圖3 引物M-Pi9對(duì)BC1F1的單株篩選Fig.3 Screening of BC1F1 by primer M-Pi9

1：抗蟲(chóng)親本桂恢1561；2：改良株系; TN1：感蟲(chóng)對(duì)照；RH：抗蟲(chóng)對(duì)照；9：托盤(pán)編號(hào)1: Resistance parent Guihui1561; 2: GH18-1 Improved lines GH18-1; TN1: Susceptible CK; RH: Resistance CK; 9: Tray number圖4 苗期集團(tuán)法鑒定褐飛虱抗性Fig.4 Identification of resistance to brown planthopper by seedling group method

2.2 分離世代的單株檢測(cè)

恢復(fù)系回交改良過(guò)程中選擇保留含Pi9抗性基因且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株進(jìn)行回交。在BC1F1群體中，共檢測(cè)了20個(gè)單株，其中有9個(gè)單株含Pi9雜合基因，部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3(6、7、8、10、11和12為含目標(biāo)基因的雜合體)。在BC2F1群體中共檢測(cè)了20個(gè)單株，其中含Pi9合基因的有8株，混收獲得BC2F2。大區(qū)種植BC2F2，并利用分子標(biāo)記MRG2329、MS5和M-Pi9對(duì)單株進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到17株含3個(gè)抗性基因的純合單株，從中篩選獲得GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18等4個(gè)農(nóng)藝性狀與桂恢1561相近的改良恢復(fù)系單株。

2.3 親本及改良株系的褐飛虱及稻瘟病抗性鑒定與比較

2次褐飛虱苗期抗性鑒定結(jié)果表明，感蟲(chóng)親本桂99+Pi9對(duì)褐飛虱的抗性為中感，而抗蟲(chóng)親本桂恢1561的抗性略低于抗性對(duì)照RH；桂恢1561改良株系GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18均達(dá)到抗級(jí)水平，4個(gè)株系之間抗性區(qū)別不大，其中抗性最好的是GH18-18(表2，圖4)。

在2018年上半年對(duì)鑒定材料進(jìn)行了苗葉瘟抗性鑒定和黃熟期穗頸瘟抗性鑒定。與親本桂恢1651相比，改良株系GH18-18稻瘟病抗性明顯提高，穗頸瘟抗級(jí)達(dá)到3.8級(jí)；輪回親本桂恢1561對(duì)稻瘟病抗性綜合指數(shù)為6.8級(jí)，抗性評(píng)價(jià)為感，桂恢1561的4 個(gè)改良株系抗性綜合指數(shù)均在4級(jí)以下，抗性評(píng)價(jià)為抗，其中抗性表現(xiàn)最好的是GH18-7(表3，圖5)。綜合褐飛虱及稻瘟病抗性鑒定結(jié)果，桂恢1561改良株系GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18既抗褐飛虱又抗稻瘟病。

2.4 親本及改良株系的農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)與比較

如表4所示，與輪回親本相比，4個(gè)改良株系的3個(gè)農(nóng)藝性狀得到了不同程度的改良，主要表現(xiàn)為生育期縮短，單株有效穗數(shù)增加，千粒重降低；除了GH18-18，其余3個(gè)株系的株高均比親本桂恢1561高；穗長(zhǎng)變短，每穗總粒數(shù)有2個(gè)株系較輪回親本高，結(jié)實(shí)率都在80 %以上。結(jié)果表明，在含抗褐飛虱基因Bph14、Bph15的親本桂恢1561中導(dǎo)入抗稻瘟病基因Pi9是可行的，對(duì)產(chǎn)量性狀影響不大，部分農(nóng)藝性狀甚至優(yōu)于輪回親本。

表2 褐飛虱苗期抗性鑒定結(jié)果

表3 稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

表4 正常水田條件下的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

圖5 稻瘟病抗性鑒定Fig.5 Rice blast resistance identification

3 討 論

當(dāng)前，許多抗病蟲(chóng)基因已經(jīng)被成功定位和克隆，且有一部分被廣泛應(yīng)用于抗性育種中，抗病蟲(chóng)的水稻品種培育也取得了一定進(jìn)展。根據(jù)分子設(shè)計(jì)育種的原理與要求，通過(guò)MAS技術(shù)進(jìn)行基因聚合，將不同的抗病蟲(chóng)基因相組合將會(huì)為新育成水稻品種提供更加穩(wěn)定和持久的抗性[28]。

利用MAS技術(shù)聚合水稻抗性基因的研究成果頗豐，一些水稻新品系已成功選育，且部分品種(組合)已經(jīng)通過(guò)審定。倪大虎等[29]利用MAS技術(shù)將Xa23和Pi9基因聚合在一起，聚合系既抗白葉枯病又抗稻瘟病，抗性和抗譜均與親本相當(dāng)。Liu等[30]利用MAS技術(shù)將2個(gè)抗褐飛虱基因Bph3和Bph27(t) 導(dǎo)入易感品種Ningjing 3中，得到的聚合系在很大程度上提高了對(duì)褐飛虱的抗性，避免了由于褐飛虱影響而造成的產(chǎn)量損失。李進(jìn)波等[24]以GD-7為稻瘟病抗性基因供體、揚(yáng)稻6號(hào)為受體，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育結(jié)合MAS，選育出10個(gè)雙基因(Pi1和Pi2)純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系。Xiao等[31]將抗白葉枯病基因Xa23以及抗褐飛虱基因Bph14和Bph15通過(guò)分子標(biāo)記輔助回交策略導(dǎo)入恢復(fù)系華占中，不僅提高了華占的抗性，而且改良后水稻的產(chǎn)量也有所增加。孫富等[32]以含廣譜稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的材料BL122為供體親本，紅色特種秈稻桂紅一號(hào)為受體親本，通過(guò)雜交、回交和自交并結(jié)合MAS技術(shù)，將Pi1和Pi2基因?qū)牍鸺t一號(hào)中，獲得了攜帶2個(gè)抗性基因的高抗稻瘟病改良材料。

然而，目前已成功選育和推廣的水稻品種中，抗褐飛虱的品種僅占少數(shù)，聚合抗褐飛虱基因和抗稻瘟病基因的品種更少。本研究組自2012年起在廣西岑溪市建立了稻瘟病鑒定點(diǎn)，綜合幾年的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)含Pi9基因的材料田間抗性表現(xiàn)最好。優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系桂恢1561具有抗褐飛虱、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良、配合力好等優(yōu)點(diǎn)。本研究以桂恢1561為輪回親本，與稻瘟病抗性材料桂99+Pi9進(jìn)行雜交和回交，通過(guò)稻瘟病和褐飛虱抗性鑒定及評(píng)價(jià)，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，篩選出了一批與輪回親本桂恢1561遺傳背景相近且含Bph14、Bph15和Pi9雙抗病蟲(chóng)害純合基因的材料。在本研究成果的基礎(chǔ)上，本研究組將繼續(xù)開(kāi)展以下育種實(shí)踐：繼續(xù)種植4個(gè)改良株系材料，系選使其農(nóng)藝性狀穩(wěn)定；用雙抗病蟲(chóng)害的穩(wěn)定恢復(fù)系與生產(chǎn)上骨干三系不育系廣泛測(cè)優(yōu)配組，培育抗病蟲(chóng)害強(qiáng)優(yōu)組合，加快生產(chǎn)應(yīng)用。

4 結(jié) 論

通過(guò)常規(guī)回交育種、分子標(biāo)記輔助選擇和抗病蟲(chóng)鑒定相結(jié)合的方法，篩選獲得了4份聚合褐飛虱抗性基因(Bph14和Bph15)和稻瘟病抗性基因Pi9的水稻病蟲(chóng)害雙抗中間材料，為選育新的雙抗恢復(fù)系提供種質(zhì)資源。