土荊芥揮發油誘導玉米保衛細胞Caspase依賴性凋亡及信號調節

黃 素，李 潔，馬丹煒*，花敏瑞，江文倩，肖 楊，陳麗娜，全津瑩

(1.四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610101；2.四川省農業科學院農業信息與農村經濟研究所，四川 成都 610066)

【研究意義】玉米(ZeamaysL.)是我國種植面積最大的重要作物，遍及二十多個省區，用途廣泛[1]。多種非生物脅迫會影響玉米的生長發育，導致玉米減產，如光照較弱時玉米籽粒敗育粒增加、體積減小、干重降低[2]；干旱脅迫導致玉米葉片光系統Ⅱ和抗氧化酶系統受損[3]；土壤含水量過高時玉米幼苗生物量顯著下降等[4]，而生物脅迫研究較少。【前人研究進展】土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL.)為藜科藜屬一年生或多年生的芳香性草本入侵植物，原產美洲熱帶，極易擴散于農田中，該種含有毒揮發油，對其他植物產生化感作用[5]。研究表明，土荊芥揮發油可使玉米根尖細胞內ROS爆發，相關基因表達改變，抗氧化系統受到影響[6]，阻礙玉米根毛發育，降低玉米種子活力，從而影響玉米的生長發育，成為優勢物種[7]。【本研究切入點】氣孔保衛細胞是植物響應外界的第一門戶，對保衛細胞不利的脅迫將影響植物的光合作用，ROS、NO和Ca2+等信號分子常參與調節細胞對外界脅迫的響應[8]，而土荊芥揮發油是否影響玉米保衛細胞的功能及其作用機制不得而知。【擬解決的關鍵問題】因此，本研究以玉米為對象，分析土荊芥揮發油對其保衛細胞的毒性作用，首次利用末端脫氧核苷酸轉移酶生物素-dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測化感脅迫后玉米保衛細胞凋亡情況，探討保衛細胞核形態、活性及胞內信號分子對土荊芥化感脅迫的響應，有利于揭示土荊芥誘導的保衛細胞凋亡現象及其機理，為深入了解入侵植物的脅迫機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

土荊芥地上部分采于四川成都包江橋，水蒸氣蒸餾法提取揮發油[9]，無水Na2SO4干燥，4 ℃保存；玉米種子(雅玉26#)購于四川西南科聯種業公司；TUNEL試劑盒產自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培養及處理 選種后，0.5 %KMnO4消毒10 min，25 ℃暗培浸種24 h后催芽，取萌發一致的種子種于營養土中(花盆直徑14 cm，高12 cm)，25 ℃光暗周期14/10 h培養。4周取第2層平展葉片備用。

二甲基亞砜(DMSO)配制濃度為0.10 μl/μl的揮發油母液。撕取下表皮切成1 cm×0.5 cm表皮條，放入加有5 mL MES緩沖液[8]的EP管，分別加入2、4、6、8、10 μl揮發油母液，DMSO補足10 μl，25 ℃光照培養10、20、30 min，設置空白對照和溶劑對照(10 μl DMSO)。

以泛Caspase抑制劑(Z-VAD-FMK:0.05,0.1,0.15 μmol/L)，抗壞血酸(AsA:0.05,0.1,0.5 mmol·L-1)，過氧化氫酶(CAT:100, 200, 300 U·mL-1)，Ca2+螯合劑(EGTA: 0.05, 0.1, 0.5 mmol·L-1)，Ca2+通道抑制劑(LaCl3: 0.05, 0.1, 0.5 mmol·L-1)，硝酸還原酶抑制劑(NaN3:0.05,0.1,0.2 mmol·L-1)和NO合成酶抑制劑(L-NAME:0.025,0.05,0.075 mmol·L-1)為拮抗劑，分別將拮抗劑與8 μl揮發油母液加入緩沖液，混勻后放入表皮條，25 ℃光照培養30 min，設置空白對照和揮發油對照(揮發油母液8 μl)。

1.2.2 細胞活性和細胞核形態檢測 細胞活性檢測參照馬丹煒等[10]方法，AO/EB避光染色3 min，LEICA DM 3000顯微鏡觀察。細胞核形態檢測采用Feμlgen染色法[10]，Schiff試劑避光染色1 h。LEICA DFC450C顯微鏡觀察。每個處理觀察1000個保衛細胞，重復3次。

1.2.3 TUNEL檢測 將表皮條加入含8 μl揮發油母液的緩沖液中，25 ℃光照培養30 min，PBS洗滌3次，卡諾氏液4 ℃固定2 h，PBS洗滌3次，4 %(m/v)果膠酶和2 %(m/v)纖維素酶37 ℃酶解10 min，PBS洗滌3次，0.2 % Triton x-100處理30 min，PBS洗滌3次，TUNEL反應混合物避光染色90 min，PBS洗滌后制片。

1.3 數據統計與分析

Microsoft Excel 2007進行數據錄入和作圖，SPSS 17.00進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 土荊芥揮發油對玉米保衛細胞核形態的影響

形態觀察發現，對照組保衛細胞核形態規則(圖1a1,a2)，揮發油處理組保衛細胞出現核固縮(圖1b1,b2)，核斷裂(圖1c1,c2)等現象。同一處理時間下，處理組細胞核異常率較對照組顯著增加(P<0.05)，其中10 μl揮發油母液處理30 min時核異常率達到最大(75.57 %)。同一劑量下，細胞核異常率隨處理時間增加而顯著上升(P<0.05，6 μl揮發油母液處理20、30 min組間和8 μl揮發油母液處理20、30 min組間除外)。表明土荊芥揮發油對玉米保衛細胞具有強烈的毒性，且與細胞核畸變率存在劑量效應與時間效應。

a：對照；b：核固縮；c：核斷裂(1. AO/EB染色，2. Schiff試劑染色)a：CK；b：Nuclear pyknosis；c：Nuclear fragmentation(1.AO/EB staining，2.Schiff reagent staining)圖1 土荊芥揮發油處理下玉米保衛細胞核形態的變化Fig.1 Nuclear morphology changes in the guard cells of Zea mays L. exposed to volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.

圖2 土荊芥揮發油對玉米保衛細胞核形態的影響Fig.2 Effect of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.on guard cell nucleus morphology in Zea mays L.

2.2 土荊芥揮發油對玉米保衛細胞活性的影響及其信號調節

AO/EB染色后觀察發現，對照組保衛細胞的細胞核發亮綠色熒光，顯示較高活性(圖1a1)，處理組細胞核發橘紅色熒光，即細胞活性降低(圖1b1,c1)。圖3顯示，相同處理時間下，除少數低劑量組(2 μl)保衛細胞死亡率與對照組無顯著差異外，其余組均隨處理劑量增加而增大(P<0.05)，10 μl組處理30 min時，細胞死亡率高達85.94 %。同一劑量下，除2 μl組處理20、30 min之間無顯著差異外，其余組細胞死亡率均隨處理時間增加而上升(P<0.05)。可見土荊芥揮發油可誘導保衛細胞死亡，具有顯著的細胞毒性，與細胞死亡率存在劑量效應與時間效應。

大寫字母表示同一時間，不同劑量處理組間差異；小寫字母表示同一劑量，不同時間處理組間差異；P<0.05，下同Uppercase letters indicate the same time, different doses of treatment group differences; Lowercase letters that the same dose, different time treatment group differences; P<0.05, The same as below圖3 土荊芥揮發油對玉米保衛細胞活性的影響Fig.3 Effect of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.on guard cell viabilities in Zea mays L.

a：光學顯微鏡下的玉米保衛細胞；b：對照；c：TUNEL陽性a：The guard cells of Zea mays L. under optical microscope；b：CK；c：TUNEL-positive圖4 玉米保衛細胞的TUNEL原位檢測Fig.4 The TUNEL assay in the guard cells of Zea mays L.

TUNEL檢測發現保衛細胞核DNA的3′-OH斷端可被特異標記為綠色，呈TUNEL陽性(圖4c)，而對照組則不被TUNEL特異性標記呈無熒光的陰性結果(圖4b)，說明揮發油處理后，保衛細胞出現大量DNA斷裂為片段的細胞凋亡特征。加入泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后，保衛細胞死亡率顯著降低(P<0.05，圖5)，表明土荊芥揮發油誘導的玉米保衛細胞死亡屬于Caspase依賴性的細胞凋亡。

不同濃度的AsA、CAT、EGTA、LaCl3、NaN3和L-NAME分別與8 μl揮發油一起處理表皮條后，保衛細胞死亡率均顯著降低。其中,0.5 mmol·L-1AsA，300 U·mL-1CAT，0.5, mmol·L-1EGTA，0.5mmol·L-1LaCl3，0.20 mmol·L-1NaN3和0.075 mmol·L-1L-NAME處理時保衛細胞死亡率最低，分別為21.10 %、53.57 %、34.61 %、33.76 %、46.73 %和36.21 %，顯示高濃度拮抗劑處理對保衛細胞死亡的緩解作用最大。上述結果說明，ROS、NO、Ca2+等信號分子參與了土荊芥揮發油誘導玉米保衛細胞凋亡的信號調節。

LC：低濃度緩解劑；MC：中等濃度緩解劑；HC：高濃度緩解劑LC：Low concentration inhibitor；MC：Medium concentration inhibitor；HC：High concentration inhibitor圖5 拮抗劑對土荊芥揮發油誘導保衛細胞死亡的緩解作用Fig.5 Alleviating effects of antagonists on guard cell death of Zea mays L. induced by the volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.

3 討 論

3.1 土荊芥揮發油對玉米保衛細胞的毒性作用

入侵植物釋放的揮發性化感物質具有強烈的細胞毒性，如加拿大蓬(ErigeronCanadensisL.)揮發油誘導蠶豆(ViciafabaL.)保衛細胞活性降低，細胞核畸變[11]；土荊芥揮發油使大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.]根邊緣細胞數減少，存活率降低[12]；桉(EucalyptusrobustaSmith)揮發油引起萵苣(LactucasativaL.)根尖分生組織細胞核固縮，染色體發生變異，誘導細胞死亡[13]。本研究表明，土荊芥揮發油具有較高的細胞毒性，使玉米保衛細胞核形態出現核固縮、斷裂等細胞凋亡特征，導致細胞死亡，且細胞核畸變率和細胞死亡率與濃度存在劑量效應與時間效應。

3.2 ROS、NO和Ca2+參與土荊芥揮發油誘導的保衛細胞Caspase依賴性凋亡

細胞發生凋亡時，核小體間的DNA開始隨機斷裂，激活Caspase途徑，誘導內切核酸酶被活化，將DNA降解成寡聚核小體片段，促使細胞凋亡[11]。DNA片段化是細胞凋亡的重要特征，TUNEL原位末端標記法是公認檢測細胞凋亡的有效指標[14]，Li等[15]研究表明，土荊芥揮發油能誘導玉米根尖細胞核DNA斷裂，發生細胞凋亡。本研究也證實，土荊芥揮發油誘導保衛細胞活性降低，TUNEL檢測為陽性，顯示出保衛細胞核DNA斷裂，裸露出游離的3′-OH末端，具有明顯的細胞凋亡特征，加入泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可抑制該過程，說明保衛細胞發生了Caspase依賴性的細胞凋亡，這是玉米對土荊芥化感脅迫的自主響應，以防止有害物質進入其他組織，維持機體內部平衡。

化感脅迫往往伴隨著氧化脅迫，ROS是植物細胞在抵抗環境脅迫過程中的一個重要信號分子[16]，細胞具有抗氧化防御機制，正常情況下，胞內ROS含量不高，化感脅迫下，葉綠體和線粒體的功能受到影響，導致大量ROS在細胞中積累，氧化與抗氧化作用一旦失衡，核DNA將受到氧化損傷，導致堿基缺失，DNA斷裂等，凋亡可能是細胞響應這種失衡的結果[17]；NO是一種具有自由基性質的脂溶性氣體信號分子，可透過細胞膜快速擴散，已被證實作用臨近靶細胞參與眾多生理病理過程[18]，伴隨ROS爆發，細胞內NO的合成達到高峰，細胞活性將受到影響[19]。細胞常通過ROS和NO介導第二信使Ca2+信號通路響應脅迫應答，ROS激活質膜Ca2+通道引起胞外Ca2+內流，增加胞內Ca2+水平，通過活化核酸內切酶依賴性Ca2+，在核小體連接切割DNA，從而激活Caspase家族成員，導致細胞凋亡[8,11,20]。本研究中，分別加入AsA，CAT，EGTA，LaCl3，NaN3或L-NAME后，保衛細胞死亡率顯著降低(P<0.05)，推測土荊芥揮發油誘導玉米保衛細胞內ROS和NO水平升高，激活細胞膜上的Ca2+通道，導致胞內Ca2+濃度升高，激活Caspase依賴性途徑，活化核酸內切酶切割核DNA，導致核DNA片段斷裂，最終誘導保衛細胞凋亡。

4 結 論

土荊芥揮發油具有細胞毒性，導致玉米保衛細胞的核形態改變，細胞活性減低，其作用機制可能通過誘導保衛細胞內ROS和NO爆發，激活質膜Ca2+通道，引發胞內Ca2+增加，從而介導保衛細胞發生Caspase依賴性的細胞凋亡。