由核桃疫病果實上分離的一株棲稻假單胞菌YKW14

鄒路路，邢獻敏，傅本重

(湖北工程學院生命科學技術學院/特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000)

【研究意義】核桃(Juglansregia)為胡桃科胡桃屬(Juglans)高大落葉喬木，原產于中東地區，是我國重點發展的干果戰略產業之一。核桃常見的病害有30余種，重要的有疫病、炭疽病和白粉病等[1-2]。【前人研究進展】核桃疫病(Walnut blight)是世界范圍內核桃生產上最重要的細菌性病害，該病害于1901年由Pierce首次在美國加利福利亞州報道[3]，此后，在美國、意大利、法國、伊朗和中國都有嚴重的爆發[4-8]。它主要危害果實，其次是葉片、嫩梢、枝條、及花序等，一般植株病害率達70 %～90 %，果實被害率達10 %～40 %，嚴重時達95 %以上[8]，嚴重影響核桃產量和品質。Hajri等[9]發現，該病害也會引起核桃樹主干和側枝垂直潰瘍并伴隨有粘液滲出(vertical oozing canker，VOC)。此外，還可引起幼果褐色頂端壞死(Brown Apical Necrosis, BAN)癥狀，造成嚴重的落果[10-12]。一般認為核桃疫病的病原菌主要為樹生黃單胞菌核桃致病變種(Xanthomonasarboricolapv.juglandis, Xaj)。但是，2001年Belisario 等從核桃頂端褐色壞死病病果中也分離到了鐮刀菌(Fusariumspp.)等真菌，因此認為核桃頂端褐色壞死是一種復合侵染型病害[13]。2007年以來，曲文文等在山東的核桃褐色頂端壞死病果中分離出鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌[14]，楊克強等認為成團泛菌(Pantoeaagglomerans)也是它的病原物之一[15]。 棲稻假單胞菌Pseudomonasoryzihabitans之前稱棲稻黃色單胞菌Flavimonasoryzihabitans，最初于1928年在人體尿液和胃腸道樣本中鑒定出來[16]， 1985年從稻田中分離到此菌，更名為P.oryzihabitans。它是一種非發酵、氧化酶反應陰性、需氧，產黃色素的革蘭氏陰性桿狀細菌，可以引起敗血病、腹膜炎、眼內炎和菌血癥的機會主義病原菌[17-18]。2011年首次報道了9歲兒童被章魚咬傷后，感染了棲稻假單胞菌，潰瘍斑很難愈合[19]。2014年韓國報道了該菌引起的假性菌血癥爆發，推測可能是裝消毒紗布的罐滅菌不完全引起的[20]。從灰倉鼠中也發現了棲稻假單胞菌[21]。2016年，從人面部感染病灶上分離得到病原菌棲稻假單胞菌，它對喹諾酮類、碳青霉烯類、3代頭孢菌素等抗生素敏感[22]。它在多種環境來源中都有發現，從最初的稻田土壤到昆蟲和植物等來源，也可通過手術和醫用導管感染人，但關于此病菌的致病性特點不是十分清楚。覃益民等從土壤中篩選得到一株產纖維素酶增效蛋白的棲稻假單胞菌POEP1[23]。張望月等用大蠟螟從菜地和林地也誘集分離得到了棲稻假單胞菌CY04[24]。隨后，從小菜蛾3齡幼蟲腸道也分離得到該菌[25]。有報道棲稻假單胞菌在蘋果葉面也有分布[26]。對桑葉穿孔病的病原物分離鑒定，得到5種細菌43株，其中有2株為棲稻假單胞菌[27]。【本研究切入點】本文對一株分離自核桃果實疫病上的棲稻假單胞菌的生理生化和生物學特性進行了研究。【擬解決的關鍵問題】其可能為一種新的核桃病原菌，或在疫病的發生過程中起作用。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

菌株YKW14分離自云南昆明核桃典型疫病癥狀的果實，保存于本實驗室。馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、Luria-Bertani培養基(LB)、SOB (Super Optimal Broth)培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基(YPD)、NA(Nutrient Agar)培養基[28]。

1.2 試劑

壯觀霉素(Sp)、卡那霉素(Km)、氨芐青霉素鈉(Amp)和頭孢(Cep)購于Sigma公司。石硫合劑、稻瘟靈和戊唑醇等農藥由河北冠龍農化有限公司生產。氯化鈉、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、剛果紅、碘、肌酸、鹽酸二甲基對苯撐二胺及丙三醇等其他試劑為分析純。

1.3 細菌在不同培養基上的生長情況

將菌株YKW14分別劃線接種于PDA、SOB、LB、NA、YPD 5種不同培養基平板上。于28 ℃下培養3 d后觀察其生長狀況。

1.4 細菌生理生化特性、抗藥性及冰核活性能力測定

根據東秀珠等編著的《常見細菌系統鑒定手冊》，對菌株YKW14進行了甲基紅、乙醇氧化及脲酶等21項生化指標測定[28]。配制相應濃度的含藥或抗生素LB培養基平板，稻瘟靈、戊唑醇和石硫合劑為推薦使用濃度，抗生素濃度Sp(50 μg/mL)、Km(50 μg/mL)、Amp(50 μg/mL)、Cep(50 μg/mL)，再劃線接種Xaj，28 ℃下培養3 d后觀察，根據細菌是否生長判斷其抗性。冰核活性能力測定根據文獻的方法進行[29]。

1.5 細菌的分子鑒定

菌株的分子鑒定用16S rDNA和gyrB基因進行。用細菌基因組提取試劑盒(上海生工生物有限公司)提取細菌總DNA，并以此為模板，用通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA，用引物gyrB1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGC AYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)和gyrB2(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGC RTCNGTCAT-3′)擴增gyrB基因[30]。反應體系(25 μl)為：2×PCR Master Mix (上海生工生物有限公司)12.5 μl，模板DNA 1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR 產物經1.5 % 瓊脂糖凝膠電泳驗證后，擴增產物送往上海生工有限公司雙向測序。

測序結果通過NCBI數據庫在線Blast比對分析，選取同源性和一致性較高，且菌株種屬明確的相應序列，用MEGA7.0軟件Neighbour-Jioning法對它們進行系統發育樹構建(bootstrap=1000)[31]。

圖1 YKW14在5種不同的培養基上的生長狀況Fig.1 The strain YKW14 growth on 5 medium

2 結果與分析

2.1 細菌在不同培養基上的生長狀況

將菌株YKW14劃線接種于NA、LB、SOB、PDA和YPD五種培養基平板，3 d后觀察結果表明，在LB培養基平板上細菌生長濃密，長勢最好。在NA、PDA和SOB 3 種培養基上細菌也可以生長，但是生長狀況不如LB培養基好。而將該菌劃線接種到YPD平板上，其基本上不生長(圖1)。因此，后續的培養用LB培養基進行。

2.2 病原菌生理生化特性、抗藥性、冰核活性等特性分析

菌株YKW14為桿狀，在2 %氯化鈉溶液濃度的培養液中不能生長。50 ℃處理10 min后，細菌可以繼續生長，用55 ℃及更高溫度處理細菌不能生長。在分別含有抗生素Sp、Km、Amp，以及稻瘟靈、石硫合劑和戊唑醇 3 種農藥的培養基上實驗菌都能生長，說明該菌對這些抗生素和農藥都有一定的抗性。而在含有Cep的培養基上，細菌不生長，說明該菌對Cep無抗性(表1)。有許多假單胞菌有很強的冰核活性，但是該菌株未檢測到冰核活性。

2.3 菌株的分子鑒定

經測序結果表明，菌株YKW14的16S rDNA序列長為1440 bp。利用NCBI數據庫中的Blast程序分析結果表明，菌株與P.oryzihabitansUSDA-ARS(CP013987.1)和P.oryzihabitans16S ribosomal RNA(HM038118.1)等菌株的同源性最高，相似性達到100 %。用MEGA7.0軟件，按照Neighbour-Jioning法和種屬明確的7株假單胞菌，以及樹生黃單胞菌核桃致病變種 NCPP411為外群，構建系統發育樹(圖2)。菌株gyrB測序分析表明，序列長1176 bp。Blast軟件分析結果表明，其與棲稻假單胞菌和銅綠假單胞菌的同源性較高，相似性達到100 %。用同樣的方法將該菌株與其他種屬明確的7株菌的gyrB基因構建系統發育樹(圖3)。

結合菌株形態、生理生化特性以及2個保守基因的序列比較分析，將該菌株YKW14鑒定為棲稻假單胞菌Pseudomonasoryzihabitans。

3 結論與討論

核桃疫病在果實上的癥狀主要有黑斑，通常是果實側斑，在果實頂端為褐色壞死，還可能會導致樹干垂直潰瘍。其病原菌除了Xaj之外，有也報道其他菌可能起作用。本研究從云南昆明核桃園中核桃疫病的幼果側黑斑上分離到一株棲稻假單胞菌，它總是與Xaj一同被分離到。經過生理生化特性和分子鑒定，其為棲稻假單胞菌P.oryzihabitans。該菌在LB平板生長較好，在2 %氯化鈉濃度的培養基上不能生長，菌液在55 ℃下處理10 min后，再接種不能生長。該菌株對石硫合劑、稻瘟靈、戊唑醇有抗性；對抗生素壯觀霉素、卡那霉素、氨芐青霉素鈉也表現出抗性，而對頭孢無抗性。菌株的抗藥性特點可能是在核桃園長期用藥過程中選擇的結果。此前也有報道棲稻假單胞菌對氨芐青霉素、阿莫西林克拉維酸和唑啉頭孢菌素等有抗性[31]。

表1 菌株YKW14生理生化特性及抗藥性

注：“+”指反應呈陽性；“-”指反應呈陰性。

Note: + indicates positive; - indicates negative.

圖2 基于16S-rDNA的相似菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S-rDNA homologies.

圖3 基于gyrB的相似菌株系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB homologies

棲稻假單胞菌P.oryzihabitans存在和來源于多種環境條件。在動物、植物和土壤環境中都有報道。本文從核桃發病果實的患病處分離到了該菌，它可能是核桃病害的一種新的病原菌，或者與其他菌一起復合侵染引起病害，其單獨或在復合侵染中的致病性作用還需要進一步的確認。