2型糖尿病患者常見體質與IL-6、IL-10、IL-10R1基因多態性的相關性研究

沈 艷，唐 紅，周 端，陳昕琳，王佑華

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032)

糖尿病是由先天遺傳和后天環境等因素共同作用而導致的一組以糖代謝紊亂為主要表現的臨床綜合征。在個人稟賦和環境因素影響下，不同個體有不同的證候表現，而相對穩定和整體性的癥狀和體征便會成為研究一種疾病異質性從而更有效地指導臨床的線索[1]。這種相對穩定和整體性的癥狀和體征常反映個體的中醫體質，而體質與基因間有著密切的相關性。臨床研究也顯示，2型糖尿病患者常伴隨多種炎癥因子濃度的改變，考慮其發病可能與相關炎癥因子有關[2-3]。因此，筆者研究2型糖尿病患者常見體質陰虛質和痰濕質與炎癥因子白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)及其受體的多態位點的相關性。

1 資料與方法

1.1 診斷標準 采用1999年WHO制定的2型糖尿病診斷標準，即有癥狀者，空腹血糖≥7.0 mmol/L，或口服葡萄糖耐量試驗中糖負荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L，或隨機血糖≥11.1 mmol/L；癥狀不典型者，必須另選一天重復測試以確診。

1.2 中醫體質分類標準 按照中華中醫藥學會《中醫體質分類與判定》[4]進行中醫體質類型的判定。

1.3 臨床資料 395例2型糖尿病患者均來自2015年1月至2016年6月龍華醫院及4家社區衛生服務中心，均經門診或體檢確診，其中男172例，平均年齡(74.71±7.35)歲，女223例，平均年齡(73.12±8.37)歲。按是否陰虛質分為：陰虛質137例，其中男50例，女87例，平均年齡(71.72±7.97)歲；非陰虛質258例，男122例，女136例，平均年齡(74.33±7.47)歲。按是否痰濕質分為：痰濕質92例，其中男29例，女63例，平均年齡(71.89±7.92)歲；非痰濕質303例，其中男143例，女160例，年齡(74.32±7.79)歲。

1.4 納入標準 年齡45～85歲，性別不限，符合診斷標準。研究對象陰虛質轉化分≥40分，判定為“是”者，或30～39分，判定為“傾向是”者，均被納入陰虛質組。痰濕體質轉化分≥40分，判定為“是”者，或30～39分，判定為“傾向是”者，均被納入痰濕質組。

1.5 排除標準 伴有心、肺、肝、腎、血液及胃腸道嚴重原發病者；各種病毒、細菌感染者，傳染性疾病、精神疾患或行為障礙者；因文化程度等因素不能很好地理解調查問卷內容者。

1.6 觀察指標和檢測方法

1.6.1 中醫體質分類 采用問卷調查法，《中醫體質分類與判定》共分9種中醫體質類型，共有9個亞量表構成67個條目，信息采集形式采用自我評價結合臨床中醫師訪談。收集所有研究對象的臨床資料，包括姓名、性別、年齡等。

1.6.2 基因檢測 本研究選取IL-6、IL-10及白細胞介素-10受體1(interleukin-10 receptor 1, IL-10R1)基因多態性研究作為切入點。對入選對象均進行中醫體質辨識并檢測IL-6的rs1800796位點、IL-10的rs1800871位點、IL-10R1的rs2228055位點的基因分型。抽取患者外周血作為檢測樣本，所有研究對象抽血前空腹10 h，均于上午7:00-8:00抽取靜脈血2 mL，然后注入含肝素抗凝劑的真空管中混勻，置于4 ℃冰箱保存待用。首先采用QIAGEN的Flexigene DNA試劑盒提取全血提取DNA，再運用SNP技術平臺的多重PCR進行DNA的基因多態性檢測。根據基因多態性位點的位置，由上海生工生物工程股份有限公司分別用Primer3設計合成引物，并做ePCR驗證。實驗步驟：①對DNA片段進行擴增；②對PCR產物進行純化；③進行SNaPshot PCR擴增；④對SNaPshot PCR產物進行純化；⑤電泳樣品制備；⑥GeneMapper 4.0軟件分析。IL-6的rs1800796位點上游引物為GCACAGAGAGCAAAGTCCTC，下游引物為AGCTGAAGTCATGCACGAAG；IL-10的rs1800871位點上游引物為CATTCTATGTGCTGGAGATGG,下游引物為TTGCCCATTCCAGAATACAA；IL-10R1的rs2228055位點上游引物為TCATTTTTGTTTCAGTTCACACAC，下游引物為AGCAGCACCTAACACAGTGG。

2 結果

2.1 基因測序結果 IL-6 rs1800796存在C/G多態性，有GG型、CC型和GC型3種基因型。IL-10 rs1800871存在C/T多態性，有CC型、TT型和CT型3種基因型。IL-10R1 rs2228055存在A/G多態性，有AA型、GG型和GA型3種基因型。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗 采用χ2檢驗對各觀察組3種基因的基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，以上結果顯示陰虛質組、痰濕質組IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型分布實際值與預期值的差異無統計學意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。結果表明納入的2型糖尿病人群樣本來自一個較大的、處于隨機分配平衡狀態的群體，具有群體代表性。見表1、表2。

表1 陰虛質、非陰虛質各組基因的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

注：純合子預期基因型頻率=某等位基因頻率的平方，雜合子預期基因型頻率=2×兩種等位基因頻率的乘積，預期例數=總數×預期頻率

表2 痰濕質、非痰濕質各組基因的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

注：純合子預期基因型頻率=某等位基因頻率的平方，雜合子預期基因型頻率=2×兩種等位基因頻率的乘積，預期例數=總數×預期頻率

2.3 陰虛質、痰濕質IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型與等位基因分布情況比較 采用R行×C列χ2檢驗，痰濕質與非痰濕質2型糖尿病患者IL-10 rs1800871基因型分布的差異有統計學意義(P<0.05)，進一步分析顯示：痰濕質組CT基因型比例明顯低于非痰濕質CT基因型比例(30.4%vs45.9%，χ2=6.137，P=0.013)。兩組間IL-6 rs1800796、IL-10R1 rs2228055基因分型分布的差異均無統計學意義(P>0.05)。陰虛質和非陰虛質2型糖尿病患者IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型分布的差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3、表4、表5。

表3 陰虛質和痰濕質2型糖尿病患者IL-6 rs1800796基因型與等位基因分布頻率比較

表4 陰虛質和痰濕質2型糖尿病患者IL-10 rs1800871基因型與等位基因分布頻率比較

注：與非痰濕質比較，*P<0.05

表5 陰虛質和痰濕質2型糖尿病患者IL-10R1 rs2228055基因型與等位基因分布頻率比較

2.4 陰虛質、痰濕質IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型非條件Logistic回歸分析 以陰虛質(1=是，0=否)為應變量，以IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055各基因型為自變量，進行二項分類Logistic回歸分析。結果提示，以IL-10 rs1800871 CC為參照，L-10 rs1800871 CT為2型糖尿病陰虛質的主要危險因素(P=0.019，OR值為2.593，95% CI為1.710～5.746)。以痰濕質(1=是，0=否)為應變量，以IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055各基因型為自變量，進行二項分類Logistic回歸分析。結果提示，以IL-10 rs1800871 CT為參照，IL-10 rs1800871 TT為2型糖尿病痰濕質的主要危險因素(P=0.025，OR值為1.809，95% CI為1.076～3.041)。見表6、表7。

表6 2型糖尿病患者陰虛質的多因素非條件Logistic回歸分析

表7 2型糖尿病患者痰濕質的多因素非條件Logistic回歸分析

3 討論

炎癥因子是形成慢性炎癥的一個重要因素[5]，能調節多種細胞的炎癥和免疫應答[6]，它由促炎因子和抗炎因子所組成，二者決定著炎癥的形成、發展和消退。目前認為炎癥因子中腫瘤壞死因子、IL-6和C反應蛋白是反映慢性炎癥的主要指標。IL-10與心血管事件的相關性研究顯示其對動脈粥樣硬化斑塊的形成具有保護作用[7]。rs1800871位于IL-10基因啟動子區域，其變異對IL-10基因的表達具有影響作用[8]。有學者研究發現，IL-10 rs1800871基因位點的C等位基因與頸動脈內膜中層厚度具有相關性[9]。有學者對中國人群IL-10基因多態性與2型糖尿病遺傳關聯性作薈萃分析顯示，IL-10基因的SNP43位點多態與2型糖尿病存在一定遺傳關聯性[10]。

中醫治未病思想源遠流長，《素問·四氣調神大論》明確指出：“圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂。”這一思想對糖尿病及其并發癥早期防治具有重要意義[11-12]。1980年代王琦等主編的《中醫體質學說》標志著中醫體質學說的正式確立。中醫體質稟受于先天，得養于后天，說明先天的遺傳基因是中醫體質形成的基礎，它決定著個體的某些特性在生命過程中不會輕易受環境改變。不同中醫體質人群疾病的轉歸及對邪氣的易感性存在差異。孫理軍等[13]對糖尿病患者進行體質調查，發現痰濕質與陰虛質占一半以上。韓文壇[14]對糖尿病患者進行研究，顯示以平和質、陰虛質、氣虛質及痰濕質為主，陰虛質、氣虛質及痰濕質是導致生存質量嚴重下降的主要體質。結合筆者前期的研究結果，糖尿病患者的體質主要是陰虛質及痰濕質。《靈樞·五變》曰：“五臟皆柔弱者，善病消癉。”尤以陰虛體質最易患病，糖尿病患者多見陰虛質，與其“陰虛為本，燥熱為標”基本病機相一致；過食肥甘厚味，導致脾胃運化失職，釀生痰濕，日久導致肥胖，胰島素敏感性降低引起糖尿病，正如《素問·奇病論》所說“此肥美之所發也”。

本研究結果顯示，痰濕質2型糖尿病患者IL-10 rs1800871 CT基因型比例明顯低于非痰濕質(P<0.05)，可能IL-10 rs1800871 CT基因型為痰濕質保護因素。多因素非條件Logistic回歸分析結果提示，以L-10 rs1800871 CC基因型為參照，IL-10 rs1800871 CT基因型為2型糖尿病陰虛質的主要危險因素(P=0.019)；以IL-10 rs1800871 CT基因型為參照，IL-10 rs1800871 TT基因型為2型糖尿病痰濕質的主要危險因素(P=0.025)。結果提示IL-10 rs1800871基因變異可能是2型糖尿病陰虛質、痰濕質的分子遺傳學基礎之一。

本研究從分子生物學角度探討IL-6、IL-10、IL-10R1基因多態性與2型糖尿病常見體質的相關性，初步證實IL-10 rs1800871基因多態性與2型糖尿病陰虛質、痰濕質的相關性，為糖尿病患者的早期防治提供一定的客觀依據。以此針對性地改善中醫體質，調和陰陽，有利于改善體質偏頗，從而截斷或延緩疾病的發生發展[15]。但是，2型糖尿病是一種多基因相關疾病，病因涉及遺傳、環境等多種因素，其發生發展過程極其復雜，同時，IL-10也是一種多效性的細胞因子，因此本研究結果只能說明IL-10的基因多態性參與了2型糖尿病常見體質易感性的形成。IL-10基因多態性對2型糖尿病常見體質易感性的確切診斷價值，以及本研究涉及的基因與其他基因間的相互關系等，仍需擴大樣本量進一步研究。