桃紅四物湯對腦微血管內皮細胞-PC12細胞共培養體系缺糖缺氧再灌注損傷模型的保護作用

陳芳芳，韓 嵐，彭代銀，汪蒙蒙，胡壽山，夏文文

(安徽中醫藥大學藥學院 安徽省中藥復方重點實驗室，安徽 合肥 230012)

桃紅四物湯(Tao Hong Si Wu Decoction, THSWD)出自《醫宗金鑒》，近年來越來越多的研究表明THSWD對腦損傷模型具有顯著的神經保護作用[1-3]。課題組前期研究表明，THSWD治療顯著減少了由缺糖缺氧再灌注(oxygen-glucose deprivation/recovery, OGD/R)損傷誘導的細胞死亡。THSWD發揮神經保護作用，其機制可能與促進腦血管生長和抑制細胞凋亡有關[4]。細胞療法具有潛在的多效性，通過不同的方式對微環境作出反應從而發揮作用。文獻證明這種由氧和葡萄糖雙重耗盡導致的神經細胞損傷模型可以更好地模擬臨時動脈閉塞期間發生的損傷[5]。有研究報道腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)在神經細胞損傷中起關鍵作用[6]。基于PC12細胞的神經細胞特性，也被通常用于神經學研究[7]。因此本研究建立了BMECs和PC12細胞共培養模型，進一步研究THSWD對腦缺血再灌注損傷模型的氧化應激保護作用，為THSWD的臨床研究提供更多理論依據和指導。

1 材料

1.1 細胞株 PC12細胞株和BMECs均購自于賽齊(上海)生物工程有限公司。

1.2 材料與試劑 桃仁(批號 1702181)、紅花(批號 17072135)、川芎(批號 17010335)、熟地黃(批號 1705312)、當歸(批號 1611085)和白芍(批號 17110114)均購自安徽普仁中藥飲片有限公司，并經安徽中醫藥大學中藥資源教研室鑒定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；transwell小室(孔徑：0.4 μm)：美國Corning公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒：上海BestBio貝博生物；二氫羅丹明(dihydrorhodamine，DHR)：美國Sigma公司；β-actin：北京中山金橋生物技術有限公司；蛋白標準品Marker：美國Sigma公司；小鼠單克隆抗體缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、兔多克隆抗體Bcl-2、兔單克隆抗體Bax：美國Abcam公司；山羊抗鼠IgG二抗：武漢博士德生物工程有限公司；一抗稀釋液：江蘇碧云天生物技術研究所。

1.3 主要儀器 MCO-175型CO2培養箱：日本SANYO公司；Proox C21型三氣培養箱：美國Biospherix公司；MSS全波長酶標儀：美國Thermo公司。

2 方法

2.1 THSWD藥液的制備 參照第7版《藥劑學》[8]中THSWD的配伍比例(桃仁、紅花、熟地黃、當歸、白芍、川芎的質量比為3∶2∶4∶3∶3∶2)，加入上述中藥飲片總質量10倍的75%乙醇冷凝回流提取2 h，過濾，濾渣加入上述中藥飲片總質量8倍的75%乙醇冷凝回流提取2 h后過濾；將兩次濾液合并，旋轉蒸發濃縮成1.0 g/mL的濃縮液備用。

2.2 THSWD對BMECs和PC12細胞安全濃度的篩選 取對數生長期的BMECs和PC12細胞分別用胰酶消化并計數。對于BMECs和PC12組THSWD濃度設置為0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL。培養箱中培養24 h，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃、5% CO2培養箱孵育4 h，棄上清，用150 μL DMSO溶解藍紫色甲瓚，室溫避光振蕩10 min。計算細胞存活率(缺糖缺氧再灌注組OD值/空白對照組OD值×100%)。

2.3 BMECs和PC12細胞OGD/R時間篩選 取對數生長期的BMECs和PC12細胞，分別用胰酶消化并計數。對于BMECs和PC12 OGD/R組設置為缺糖缺氧0、2、4、6、8、12 h，缺糖缺氧條件為95%高純N2、5% CO2，復糖復氧24 h，MTT法檢測細胞存活率。

2.4 BMECs和PC12共培養模型建立 借助Transwell小室建立共培養體系，無菌條件下，將BMECs(1×106/mL)接種于6孔板底部，另取空白孔放上Transwell小室，將PC12(1×106/mL)接種在Transwell小室中，待兩種細胞均貼壁生長后，吸棄原培養基，將Transwell小室移到種有BMECs的孔中，建立起共培養體系。

2.5 實驗分組和給藥 對照組：無血清高糖培養基在正常CO2培養箱中培養；OGD/R組：無血清無糖培養基在缺氧小室中先培養4 h，再更換為無血清高糖培養基在正常CO2培養箱培養24 h；THSWD低、中、高劑量組：終濃度為0.2、0.4、0.8 mg/mL的THSWD無血清高糖培養基分別預處理BMECs 24 h，吸去培養液，共培養體系用無血清無糖培養基在缺氧小室中先培養4 h，再更換為無血清高糖培養基在正常CO2培養箱培養24 h。

2.6 指標檢測

2.6.1 細胞活力及形態檢測 取對數生長期的BMECs和PC12細胞。另取空白孔放上Transwell小室，將PC12(1×106/mL)接種在Transwell小室中，待細胞貼壁生長至80%左右，吸棄原培養基，將Transwell小室移至種有BMECs的孔中，建立起共培養體系，進行分組干預。細胞處理完成后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，并拍照。然后每孔加入5 mg/mL MTT 280 μL，反應4 h后，吸去上清，再加DMSO溶解甲瓚結晶，在490 nm波長下檢測，每組設3個復孔。

2.6.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法測定OGD/R誘導的共培養體系中PC12細胞凋亡率 細胞處理完成后，用不含EDTA的胰酶消化Transwell小室內PC12細胞，離心，取上清。加入400 μL 1×Annexin Ⅴ結合液懸浮細胞，5 μL Annexin-FITC染色液，輕輕混勻后避光保存15 min，溫度為2～8 ℃。然后加入10 μL PI染色液避光孵育5 min，溫度為2～8 ℃，流式細胞儀檢測，每組設3個復孔。

2.6.3 DHR檢測OGD/R誘導的共培養體系中PC12細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平 細胞處理完成后，吸去Transwell內原培養基，用不含血清的培養基清洗2次，加入5 μmol/L的DHR溶液1 mL，避光孵育1 h，然后用胰酶消化細胞并離心收集，1 000 r/min離心5 min，離心后PBS吹打，用PBS重懸制成細胞懸液。處理完后用流式細胞儀檢測，每組設3個復孔。結果用平均熒光強度(mean fluorescent intensity ，MFI)值表示。

在使用時，通過設置橫桿2，當需要清理白板1的版面時，通過移動橫桿2到適當的位置，下壓把手16，帶動橫桿2向下運動，可使圓筒擦8和方擦15與白板1接觸，通過設置圓筒擦8兩側的方擦15，可三重清理白板1的表面，從而達到清理白板1表面更加干凈的目的，通過設置固定塊3和滑塊4，使橫桿2的移動更加穩定、快速和方便，通過設置固定桿9底部的滾輪11與滾槽10，不僅可支撐橫桿2，且使橫桿2的移動更加穩定，且通過設置限位彈簧7，在不需要清理時，圓筒擦8與白板1不接觸。

2.6.4 OGD/R誘導的共培養體系中PC12細胞內MDA含量及SOD、GSH-Px活性檢測 細胞處理完成后，按照試劑盒說明書測定其中MDA含量、SOD及GSH-Px活力。

2.6.5 Western blot法檢測OGD/R誘導的共培養體系中PC12細胞內Bax、Bcl-2及HIF-1α蛋白表達水平 細胞處理完成后，棄去培養液，用細胞刮輕輕刮下Transwell內細胞并收集。1 500 r/min離心5 min，去上清，加入含PMSF的蛋白裂解液150 μL，在冰上裂解30 min后，4 ℃、15 000 r/min離心15 min。取10 μL作蛋白定量，其余蛋白溶液加入上樣緩沖液，沸水煮5 min，-20 ℃冰箱保存。之后電泳，轉膜，室溫下封閉，4 ℃孵育過夜，加二抗孵育，搖床振搖洗膜4次。

3 結果

3.1 THSWD安全濃度及缺糖缺氧再灌注時間的篩選

3.1.1 THSWD對BMECs和PC12細胞安全濃度的篩選 采用MTT法檢測THSWD對正常培養的BMECs細胞的作用。結果表明，在一定濃度范圍內THSWD可以促進BMECs的增殖，其中0.2、0.4 mg/mL THSWD對BMECs細胞增殖的促進作用最明顯，而0.2、0.4、0.8 mg/mL THSWD對PC12細胞增殖的促進作用最為明顯。見表1。

3.1.2 BMECs和PC12細胞OGD/R時間篩選 結果表明，OGD/R時間對BMECs增殖的抑制作用在缺糖缺氧4、6、8 h時明顯，復糖復氧24 h后，OD值分別為(0.308±0.037)、(0.200±0.020)和(0.158±0.065)。而對PC12細胞增殖的抑制作用最大，在缺糖缺氧4、6、8 h和復糖復氧24 h的OD值依次是(0.168±0.037)、(0.120±0.019)、(0.110±0.046)。因此，OGD/R誘導的BMECs和PC12共培養體系損傷的最佳時間為缺糖缺氧4 h，復糖復氧24 h。

表1 MTT法檢測THSWD對BMECs和PC12細胞存活率的影響

3.2 THSWD對OGD/R誘導的共培養體系中PC12細胞活力的影響 與對照組比較，OGD/R組OD值顯著降低(P<0.05)。與OGD/R組比較，0.2、0.4、0.8 mg/mL THSWD組OD值均顯著增高(P<0.05)。見圖1。

注：A.對照組；B. OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

3.4 THSWD對OGD/R誘導的共培養體系中PC12細胞凋亡率的影響 與對照組比較，OGD/R組PC12細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與OGD/R組比較，0.2、0.4、0.8 mg/mL THSWD組PC12細胞凋亡率均顯著下降(P<0.05)。見圖3、圖4。

3.5 THSWD對OGD/R誘導的共培養體系中PC12細胞ROS的影響 與對照組比較，OGD/R組PC12細胞內ROS水平顯著升高(P<0.05)；與OGD/R組比較，0.2、0.4、0.8 mg/mL THSWD組共培養體系中PC12細胞ROS水平均顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注:A.對照組;B. OGD/R組;C. 0.2 g/mL THSWD組;D. 0.4 g/mL THSWD組;E. 0.8 g/mL THSWD組

圖2倒置顯微鏡下觀察THSWD對OGD/R誘導的

共培養體系中PC12細胞形態的影響(10×10倍)

注:A.對照組;B. OGD/R組;C. 0.2 g/mL THSWD組;D. 0.4 g/mL THSWD組;E. 0.8 g/mL THSWD組

圖3流式細胞儀檢測各組共培養體系中PC12細胞凋亡率

3.6 THSWD對OGD/R誘導的共培養體系中PC12中MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響 與對照組比較，OGD/R組PC12細胞中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與OGD/R組比較，0.2、0.4 mg/mL THSWD組MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。0.8 mg/mL THSWD組GSH-Px活性也顯著升高(P<0.05)。見圖6。

注：A.對照組；B.OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

注：A.對照組；B.OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

3.7 THSWD對OGD/R誘導的共培養體系PC12細胞中Bcl-2、Bax和HIF-1α蛋白表達的影響 與對照組比較，OGD/R組HIF-1α蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與OGD/R組比較，0.2、0.4 mg/mL THSWD組HIF-1α蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與對照組比較，OGD/R組Bax蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著減少(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著下調(P<0.05)；與模型組比較，0.2、0.4 mg/mL THSWD組Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著上調(P<0.05)，0.8 mg/mL THSWD組Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖7、圖8。

注：A.對照組；B.OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

注：A.對照組；B. OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組

圖7Westernblot法檢測各組共培養體系PC12細胞中Bcl-2、Bax和HIF-1α蛋白表達水平

4 討論

缺血/再灌注損傷具有高病死率和高致殘率。由于氧氣的高消耗，氧化還原穩態在大腦中起重要作用[9]。許多臨床和實驗研究觀察表明氧化應激在發病機制和發展中的作用。研究發現，ROS和MDA的含量以及SOD和GSH-Px的活性在缺血再灌注損傷中起著非常重要的作用。過量的細胞內ROS可能會影響細胞內的氧化還原平衡[10]，ROS導致分子受損，這有助于直接與DNA、蛋白質和脂質發生反應。MDA水平升高也與自由基損傷有關。SOD和GSH-Px是抗氧化應激生理防御的一部分[11]。

注：A.對照組；B.OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

在課題組前期研究中，已經證明THSWD治療可顯著改善OGD/R損傷，降低MDA和ROS水平，并促進SOD和GSH-Px的活性。

在缺血性腦卒中的生物學過程中，HIF-1α在細胞凋亡過程中發揮著重要的作用，與Bax蛋白的表達之間存在負相關關系，而與Bcl-2蛋白的表達之間存在正相關關系，從而可以起到抑制細胞凋亡的作用[12]。Bax/Bcl-2比值代表了細胞凋亡和增殖之間的平衡[13]。本研究表明，THSWD通過上調HIF-1α和Bcl-2表達水平和下調Bax表達水平保護PC12細胞免受OGD/R誘導的損傷。

神經血管單元構成復雜的通訊網絡[14]。據報道，BMECs分泌許多與OGD/R相關的細胞因子。動物實驗和臨床試驗證實BMECs對神經細胞損傷和神經退行性疾病的保護作用。研究發現，當與間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)共培養時，內源性IL-6可減少細胞凋亡并保護OGD損傷的PC12細胞[15]。與MSC共培養可以保護PC12免受缺氧誘導的損傷，這可能與MSC中促紅細胞生成素基因表達增加有關[16]。研究表明，THSWD中羥基紅花黃色素A和阿魏酸對OGD/R模型中BMECs具有保護作用[17-18]。

氧化應激在腦缺血/再灌注損傷發病機制中的作用日益受到重視。THSWD作為活血化瘀的經典方，具有保護內皮損傷、抗氧化、抗血小板活化等作用[19-21]。課題組前期相關研究已經表明，THSWD對擬缺血損傷人BMECs具有保護作用，其機制與增強細胞抗氧化能力有關[22]?？傊狙芯拷Y果表明，THSWD在BMECs-PC12共培養體系中被證實具有抗氧化作用。THSWD可顯著增強共培養體系中PC12細胞的活性，增強PC12細胞抗氧化和清除氧自由基的能力，改善細胞損傷，抑制細胞凋亡。