加味陽和湯對腎陽虛型骨質疏松模型大鼠骨密度及血清微量元素的影響

曹端廣，夏漢庭，楊文龍，楊 佛，劉 璞，李 威，王書豪，楊鳳云

(1.江西中醫藥大學臨床醫學院，江西 南昌 330000；2.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330000)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨微結構破壞，骨骼強度下降，骨量丟失為典型特征的一種骨代謝性疾病。其具有高發病率、高致殘率的特點，危害巨大，是僅次于心血管疾病的第二大高發疾病[1-2]。隨著人口的老齡化，OP的發病率也在持續上升。據統計，目前中國的OP患者約有9 000萬人，到2050年將驟增至2億多人，占總人口的13.2%[3]。

加味陽和湯是江西中醫藥大學附屬醫院骨傷科國家級名老中醫許鴻照的經驗方，由陽和湯加雞血藤、木瓜、漢防己發展而來。許鴻照在臨床診治OP的過程中發現，OP患者多有腎陽虛的表現，而加味陽和湯具有“補腎、溫陽通絡”之功，在臨床上有針對性地運用于腎陽虛型OP患者，取得了較好的臨床療效。

在臨床經驗總結的基礎上，本實驗從基礎醫學的角度出發，通過維甲酸灌胃、氫化可的松臀部肌肉注射復制腎陽虛型OP模型大鼠，檢測大鼠股骨骨密度(bone mineral density，BMD)及血清微量元素的變化，探究加味陽和湯對腎陽虛型OP模型大鼠的治療作用及其可能機制。

1 材料

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠48只，3月齡，體質量(180±20)g，購自江西中醫藥大學實驗動物科技中心[動物生產許可證號：SCXK(贛)2018-0003]。

1.2 主要儀器 Hologic QDR-2000型雙光能骨密度儀、Bio-Tek ELx800型連續波長酶標儀：美國生產；W2-100SP型旋轉蒸發儀：上海申生。

1.3 藥物及試劑 維甲酸(存貨編號 R817255)、羧甲基纖維素鈉(存貨編號 C804638)：上海麥克林生物科技有限公司；氫化可的松(國藥準字 H12020885，每支2 mL，含氫化可的松10 mg)：天津金耀藥業有限公司；戊酸雌二醇(estradiol valerate，E2V；國藥準字 J20130009，每片1 mg)：拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒：北京四正柏生物科技有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)檢測試劑盒：武漢華美生物工程有限公司；鎂(magnesium，Mg)、鐵(ferrum，Fe)、鋅(zinc，Zn)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 不同濃度加味陽和湯的制備 加味陽和湯[雞血藤20 g，熟地黃15 g，肉桂、鹿角膠(烊化)、麻黃、白芥子、漢防己各10 g，木瓜、炮姜各6 g，甘草3 g]飲片均購于江西中醫藥大學附屬醫院中藥房，按照比例取飲片浸泡、濾過，由江西中醫藥大學藥學院中藥標準化研究實驗室制備成煎劑，分別減壓濃縮至每毫升含生藥0.5、1、2 g，4 ℃冰箱下保存備用。

2.2 腎陽虛型OP模型鼠的制備 維甲酸用1%羧甲基纖維素鈉混懸，按每日80 mg/kg灌胃給藥，持續2周，同時每日臀部肌肉注射氫化可的松，劑量為2 mg/kg，復制腎陽虛型OP大鼠模型。模型復制完成后，取正常及模型組大鼠行BMD檢測，觀察大鼠是否有神疲、乏力、靜臥、小便多等腎陽虛表現。確認模型復制成功后，將48只正常大鼠及制備的腎陽虛型OP模型鼠分為空白對照組，模型組，加味陽和湯低、中、高劑量組，陽性對照組，共6組。各組藥物制成溶液后，分別用等容積1%羧甲基纖維素鈉、不同濃度(5、10、20 g/kg)加味陽和湯、E2V(0.000 2 g/kg)灌胃(10 mL/kg)，連續6周。

2.3 大鼠一般情況觀察 觀察模型復制過程中及給藥過程中大鼠的活動、精神、毛發、體質量、食欲、食量、大小便等的變化。

2.4 骨及血清標本的采集與檢測 用烏拉坦將大鼠麻醉后，從腹主動脈取血，室溫靜置30 min，6 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存。應用ELISA試劑盒檢測血清ALP、TRAP，采用比色法檢測血清Mg水平，采用分光光度法檢測血清Fe、Zn水平。取大鼠右側股骨，采用美國 Hologic QDR-2000型雙光能骨密度儀檢測BMD值。

3 結果

3.1 一般狀況 模型復制期間，大鼠拱背、毛色晦暗、食量下降、脾氣暴躁、小便多，考慮是維甲酸及氫化可的松的不良反應，大鼠灌胃后死亡1只，尸體解剖后考慮灌胃不當，藥液灌入氣管致死。給藥后，不同劑量加味陽和湯組及陽性對照組的大鼠乏力、靜臥、小便多等腎陽虛表現得到明顯改善，活動增加，毛發漸光澤，食量及體質量均有不同程度的上升。

3.2 各組大鼠股骨BMD比較 與空白對照組比較，模型組大鼠股骨BMD顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，加味陽和湯中、高劑量組和陽性對照組BMD顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3.3 各組大鼠血清ALP、TRAP水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清ALP和TRAP活性均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清ALP、TRAP活性均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3.4 各組大鼠血清Mg、Fe、Zn水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清Mg、Fe、Zn水平均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組血清Fe、Zn水平均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，血清Mg水平的差異無統計學意義(P>0.05)；且加味陽和湯升高血清Mg、Fe、Zn水平呈現劑量依賴性。見表2。

表1 各組大鼠股骨BMD，血清ALP、TRAP活性比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 各組大鼠血清Mg、Fe、Zn水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

OP是以骨量下降為主要特征的代謝性骨病，發病率高，多集中于50歲以上的中老年人，嚴重影響老年人的生活質量。西醫針對OP的治療相當局限，主要以降鈣素、雙膦酸鹽、氟化物等治療為主，而這些藥物都具有一定的不良反應[4]。中醫稱OP為“骨痿”。腎主藏精，主骨生髓，腎陽虛是引起OP的主要原因，血瘀次之，故中醫治療重補肝腎、溫陽通經絡。方中君藥鹿角膠、熟地黃補髓強骨補肝腎；臣藥麻黃、白芥子溫陽通絡；甘草調和諸藥。該方有溫補腎陽、散寒通絡之功，能通督脈而補陽，主治腎中陽虛、血絡瘀阻之骨痿。此外，現代研究表明，鹿角膠有減少骨膠原分解，抑制骨吸收的作用[5]。

維甲酸誘導OP模型操作簡便，時間短，成功率高，在復制OP動物模型中被普遍采用。且該模型會出現全身皮毛卷曲、無光澤、懶動、少食的情況，按中醫理論，有腎陽虛表現，可用于復制OP腎陽虛模型。

BMD是臨床診斷OP的金標準[6]。模型組大鼠股骨BMD顯著低于空白對照組，有神疲、乏力、靜臥、小便多等腎陽虛表現，說明模型復制成功。各給藥組大鼠股骨BMD均高于模型組，且與加味陽和湯的濃度呈劑量依賴性，說明各給藥組對大鼠OP有治療作用，高劑量加味陽和湯改善大鼠股骨BMD效果最明顯。

ALP主要由成骨細胞合成，是骨形成的生化標志物，反映成骨細胞的活性；TRAP主要由破骨細胞分泌，是骨吸收的生化標志物，反映破骨細胞的活性[7-9]。模型組ALP、TRAP顯著高于正常對照組，可佐證維甲酸所致骨質疏松為高轉換型骨質疏松，骨形成及骨吸收活動加強，但骨吸收速度遠高于骨形成，骨量丟失，形成OP[10-11]。各給藥組大鼠血清ALP均高于空白對照組，說明各給藥組均可不同程度地促進骨形成。各給藥組大鼠血清TRAP活性均降低，說明各給藥組的骨吸收被不同程度地抑制。

微量元素在人體中含量極少，但在抗病、防癌等方面作用巨大，與人的健康息息相關，維持人體正常的生理活動[12-13]。不同濃度的加味陽和湯對血清Mg、Fe、Zn等微量元素均具有上調作用，可引起礦物質的沉積，增加骨密度，抗骨質疏松。

綜上所述，不同劑量加味陽和湯組給藥后，大鼠乏力、靜臥、小便多等腎陽虛表現得到明顯改善，大鼠股骨BMD及血清微量元素均有不同程度的上升，說明加味陽和湯對OP的防治作用與其補肝腎、溫陽通經絡的功效密不可分。加味陽和湯能改善維甲酸、氫化可的松所致的腎陽虛型OP模型鼠股骨BMD，促進骨形成，抑制骨吸收，引起礦物質的沉積，發揮抗骨質疏松的作用。