W/O型黃芩苷納米乳的制備及質量評價

鄭轉弟，周 安，2，吳鴻飛

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學科研實驗中心，安徽 合肥 230038)

黃芩苷是從唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根中提取分離出來的一種黃酮類化合物[1-2]，具有抑制乙型肝炎病毒復制、清除乙型肝炎病毒復制模板環狀DNA、抑制肝纖維化等藥理作用[3-4]，臨床上主要用于治療慢性乙型肝炎。研究表明，乙型肝炎病毒易藏匿于淋巴系統[5-6]，而黃芩苷常規劑型難經淋巴轉運，不能有效地富集于淋巴系統，導致慢性乙型肝炎的治療受到一定的阻礙。納米乳是一種新型淋巴靶向遞藥系統[7]，本課題組前期成功制備出W/O型黃芩苷納米乳，相對于黃芩苷混懸劑，所制備得到的W/O型黃芩苷納米乳可經淋巴轉運，極大提高了黃芩苷的生物利用度。為進一步評價W/O型黃芩苷納米乳的質量體系，本研究建立了W/O型黃芩苷納米乳的高效液相色譜分析方法，對W/O型黃芩苷納米乳中黃芩苷進行含量測定，為該制劑質量控制提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(包含G1311X四元梯度泵、G1329自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315C紫外檢測器)：美國安捷倫公司；Welch Topsil HPLC C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)：上海月旭材料科技公司；CP225D型十萬分之一電子天平：德國Sartorius公司；KQ-5200B型數控超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；DF-101B型磁力攪拌器：河南省鞏義市予華儀器責任公司；Malvern Zeta sizer Nano ZS-90納米粒徑電位分析儀：英國馬爾文儀器有限公司；SYZ-C型石英自動亞沸高純水蒸餾器：南京桑力電子設備廠。

1.2 試藥 W/O型黃芩苷納米乳及空白納米乳(批號分別為20171010、20171101、20171102、20171103、20171104、20171105、20171106、20171107、20171108、20171109)：自制；黃芩苷對照品(批號 110715-201318，含量≥98%)：中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷原料藥(批號 141201，含量為85.94%)：四川省玉鑫藥業公司；大豆磷脂：安徽省合肥沃森生物科技公司；1，2-丙二醇、肉豆蔻酸異丙酯、磷酸、甲醇(色譜純)：國藥集團化學試劑公司；蘇丹紅、亞甲藍：天津市光復精細化工公司；蒸餾水：自制；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 W/O型黃芩苷納米乳的制備及載藥量考察 精密稱取大豆磷脂10.5 g、1，2-丙二醇10.5 g、肉豆蔻酸異丙酯9 g混合置于錐形瓶中，在45 ℃恒溫下磁力攪拌至全溶，精密稱定黃芩苷原料藥313.5 mg溶于上述體系中，直至黃芩苷原料藥全部溶解在混合溶液中，室溫下往體系緩慢滴加3 g雙蒸水直至體系變為透明均勻的液體，即得W/O型黃芩苷納米乳，載藥量為9.5 mg/mL。

2.2 W/O型黃芩苷納米乳質量評價

2.2.1 外觀性狀 制備的W/O型黃芩苷納米乳外觀上均為橙黃色均一透明液體，流動性良好。

2.2.2 類型鑒別 采用染色法來判斷納米乳類型，取黃芩苷納米乳(批號 20171010)5.0 mL于兩只試管中，分別加入適量的水溶性染料亞甲基藍和油溶性染料蘇丹紅于試管中，比較兩種染料的擴散速度。結果蘇丹紅的擴散速度明顯快于亞甲基藍的擴散速度，表明制備的納米乳為W/O型納米乳。

2.2.3 粒徑分布 取W/O型黃芩苷納米乳(批號20171010)1.0 mL，用外相肉豆蔻酸異丙酯稀釋至10 mL。取稀釋后的納米乳適量，用Malvern Zeta sizer Nano ZS-90納米粒徑電位分析儀測定納米乳體系的粒徑，結果見圖1。本實驗制備的W/O型黃芩苷納米乳的平均粒徑為(63.40±1.10)nm(n=3)，PDI為(0.166±0.006)(n=3)，表明制備的W/O型黃芩苷納米乳大小均一，且分布均勻。

圖1 W/O型黃芩苷納米乳粒徑分布圖

2.3 W/O型黃芩苷納米乳的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Welch Topsil HPLCC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水(55∶45)；柱溫為30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；進樣量：10 μL。理論塔板數按黃芩苷計算，應不小于3 000。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品6.2 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得620.00 μg/mL的對照品儲備液，4 ℃條件下避光儲存。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取納米乳1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲20 min破乳。精密量取1.0 mL破乳液，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得納米乳待測樣品，避光保存。

2.3.4 方法學考察

(1)專屬性考察 分別取空白溶劑(甲醇)、黃芩苷對照品(以甲醇稀釋所得的溶液)、空白納米乳(批號 20171101，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液)、W/O型黃芩苷納米乳(批號 20171102，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液)，按“2.3.1”項下方法進行檢測，記錄色譜圖，結果見圖2。黃芩苷保留時間為9.59 min，輔料與試劑不干擾藥物測定，表明方法專屬性良好。

圖2甲醇(A)、空白納米乳(B)、黃芩苷對照品(C)、W/O型黃芩苷納米乳(D)的高效液相色譜圖(1.黃芩苷)

(2)線性關系 取對照品儲備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為12.40、31.00、62.00、124.00、186.00、248.00、310.00 μg/mL的系列溶液。按“2.3.1”項下方法進行檢測，平行測定3次，求得峰面積的平均值，以黃芩苷濃度(x)與峰面積(y)作圖，繪制標準曲線，并計算得回歸方程y=38.125x-32.384(r=0.999 7)。結果表明，黃芩苷在12.40～310.00 μg/mL范圍內與峰面積的線性關系良好。

(3)精密度試驗 取標準曲線中濃度為62.00 μg/mL對照品溶液，按“2.3.1”項的色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰面積，計算RSD為0.89%，表明儀器精密度良好。

(4)重復性試驗 精密量取W/O型黃芩苷納米乳1.0 mL(批號 20171102)，共6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下的色譜條件測定，記錄色譜峰面積，按“2.3.4”項下“(2)”之標準曲線計算黃芩苷含量，計算RSD為1.54%，表明方法重復性良好。

(5)穩定性考察 取同一供試品溶液分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h后，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積，按“2.3.4”項下“(2)”之標準曲線計算黃芩苷含量，計算RSD為1.21%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

(6)加樣回收率試驗 精密量取已知含量的W/O型黃芩苷納米乳1.0 mL(批號 20171102)，共9份，置于100 mL容量瓶中，分別精密加入9.5 mg/mL黃芩苷對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，加入一定容積的甲醇，超聲20 min破乳，最后稀釋至刻度，制得低、中、高質量濃度的黃芩苷供試品溶液，按“2.3.1”項下的色譜條件測定，記錄色譜峰面積，按“2.3.4”項下“(2)”之標準曲線計算黃芩苷含量，結果見表1。低、中、高3個濃度的平均加樣回收率分別為98.70%、99.01%、100.31%，RSD分別為0.40%、0.66%、0.87%，表明該方法準確度良好。

表1 加樣回收率試驗

2.3.5 樣品含量測定 精密量取6批W/O型黃芩苷納米乳各1.0 mL，每批3份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積，按“2.3.4”項下“(2)”之標準曲線計算黃芩苷含量，結果見表2。

表2 黃芩苷含量測定結果(n=3)

2.4 初步穩定性考察 精密量取2.0 mL W/O型黃芩苷納米乳封于安瓿瓶中(批號 20171103)，共8份，每組4份，分別進行常溫實驗(25 ℃放置30 d)和低溫實驗(4 ℃放置30 d)，分別于0、10、20、30 d時觀察納米乳的外觀形狀，并測定黃芩苷含量。結果見表3。在常溫25 ℃、低溫4 ℃條件下放置30 d，納米乳外觀澄清透明、無分層現象，且含量與0 d測定結果相比較無明顯變化，表明制備的W/O型黃芩苷納米乳在此時間內性質穩定。

表3 穩定性試驗結果

3 討論

納米乳是一種熱力學穩定體系[8]，其破乳影響藥物的釋放，選擇適宜的破乳方法對準確檢測出黃芩苷含量具有重要意義。納米乳的破乳方法主要有化學破乳法和物理破乳法[9]。預實驗中，考察了超聲破乳和甲醇、乙腈的破乳效果，結果發現，超聲無法破乳，乙腈破乳后出現渾濁，故選用甲醇作為破乳劑。同時，本實驗考察甲醇聯合超聲法對所制備的W/O型黃芩苷納米乳的破乳效果，結果發現甲醇聯合超聲條件下破乳效果最好(溶液澄明)。

文獻報道黃芩苷含量測定時流動相的體系主要為甲醇-0.2%磷酸水[10-11]，考慮到磷酸對色譜柱的損害，本實驗比較了甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液的色譜行為，結果發現兩者流動相條件下峰形無差異。因此，選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相條件，減小對色譜柱的損傷。

本實驗對W/O型黃芩苷納米乳中黃芩苷進行含量測定，以甲醇-0.1%磷酸水為流動相，色譜峰分離效果好，峰形尖銳，操作簡便，結果準確可靠，重現性好，可用于W/O型黃芩苷納米乳的質量控制和穩定性考察。