羅氏核酸檢測系統的質量控制

胡婷婷　蔣義　白穎　康香梅

[摘要] 病毒核酸檢測技術（NAT）是一項直接檢測病原體核酸的技術，隨著血站核酸檢測技術的全面覆蓋，質量保證和質量控制已成為核酸檢測的靈魂和核心。影響核酸檢測質量的因素主要可分為檢測前、檢測中和檢測后三大因素，這些因素又與人員、儀器設備、材料、方法、環境等要素相互作用共同影響著核酸檢測的質量。因此，單一因素的控制與質量分析已然無法保證核酸檢測質量，需要建立完善的質量管理體系給予全流程控制，這樣還可以有效地預防經輸血傳播病毒性疾病，降低經輸血傳播病毒的風險。

[關鍵詞] 病毒核酸檢測;技術質量控制;質量保證

[中圖分類號] R446.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2019）02（c）-0032-03

隨著血液核酸檢測工作在全國血液系統的全面深入，核酸檢測特異性強，靈敏度高，質量體系的建立與完善就顯得尤為重要[1]。質量控制的內容涵蓋于得出檢驗結果的所有步驟，包括從標本收集、檢測直至報告結果簽發的整個檢驗過程。長沙血液中心自2015年開展核酸血液篩查工作，選用國外診斷試劑羅氏血篩系統，采取6樣本混合檢測方案，現總結日常工作中對核酸檢測工作產生質量影響的關鍵點，進一步規范檢測人員對核酸擴增檢測系統的操作，提升檢測質量，達到持續改進的目的。

1? 測定前因素

1.1? 標本采集

對采集工作人員進行全員培訓，先留取酶免管，再留取核酸管，采用低溫離心機離心，留樣后加蓋顛倒混勻8次以上，樣本在檢測前冷鏈運輸的溫度是2～10℃，整個采集過程做好質量監控。

1.2? 標本接收

血液標本的接收要求：①標本與血液一一對應;②標本質量符合檢測項目技術要求，仔細核實標本是否存在凝塊、未離心、溶血、乳糜、試管是否破損[2-4]，標本量是否足量等現象，如有上述情況發生，進行相關處理措施以后再進行實驗，質量不合格，抗凝劑的種類，采集管的順序、數量和方法都會影響血液樣本中核酸的檢出;③標本信息具有可追溯性。

1.3? 實驗室設施、儀器設備

實驗室要做好關鍵儀器設備的維護、校準包括核酸提取系統、擴增判讀系統、微量加樣槍維護校準。對維修后的加樣器、擴增儀的光源、溫控系統等設備也要做好故障后的驗證工作，對于紫外燈管也要定期監測其輻射強度。我們日常實驗時需要特別注重設備的維護：①用75%乙醇重點擦拭Core-Tip金屬擋板，并放到正確的位置;②條碼夾僅供一次性使用，條碼夾與S-tube一一對應，條碼夾需放到位;③打開CAP的工程師面板，觀察洗液接頭1和洗液接頭2有沒有大顆氣泡或管路的接頭處空出一段;④觀察注射器上端有沒有大型氣泡顆粒和黑色活塞上有無白色結晶;⑤試劑針針頭部有無液滴;⑥SPU的準備（須上機前，上機后反復確認），SPU須放置方向正確，確保每個SPU兩邊緊貼SPU架，上載儀器前對每個SPU兩邊分別目測核查，避免用蠻力拍擊SPU的蓋子（會導致S-tip卡死無法拔出導致機器停機）;⑦K-tip 及K-tube的放置應注意，放置后迅速在Amplilink軟件上確認是否有耗材識別錯誤，K-tip及K-tube架可置于M-P的任意位置，K-tip及K-tube必須滿架上載，空架下載于CAP。

1.4? 理想的試劑和方法

羅氏核酸檢測試劑分為檢測試劑和對照試劑，試劑盒檢測試劑應存放于專用試劑貯存區，以防試劑受到污染。試劑使用前要做好前批號的確認，同時注意比較新舊批號之間變異系數的差異：要注意試劑穩定性：不要冷凍試劑，2～8℃保存 MPX CS1，MPX CS2，MPX CS3和MPX CS4;開瓶有效期為20 d 2～8°C;累計使用時間;COBASR AmpliPrep 儀器中累計使用40 h，連續使用時間：COBASR AmpliPrep 儀器中連續24 h。應對試劑準備、標本收集、核酸提取、測定方法和儀器操作寫出“標準操作程序”。

1.5? 人員培訓

“人”是一切工作的核心，針對核酸實驗室工作人員的培訓活動應該重點進行，嚴格按照標準操作規程執行，每一位工作人員都要有核酸實驗室“無基因”或“無核酸”的概念，防止產生的非特異性擴增結果，各區域的物品及實驗記錄均為該區專用，不得交叉使用，了解核酸每一步驟制定的目的和意義，強化防治污染的意識。對因個人操作原因導致的實驗無效，應納入人員評估過程，持續改進，增加個人培訓力度，同時應該增加人員的外出進修培訓機會，學習前沿實用的工作經驗來指導實際工作，不斷提高工作人員的操作能力及數據分析能力。

2? 測定中因素

2.1? 室內質量控制

室內質量控制是指實驗室工作人員為了決定當批測定結果的有效性，報告是否能發出而采取的一系列工作。是對實驗室測定的即時性評價。核酸檢測系統中每一個分析批均要測定一次質控品，在核酸提取中，應帶1份已知的弱陽性質控標本，其檢測結果是核酸提取和擴增有效性的綜合反映，陰性對照無擴增信號，陽性對照擴增循環次數在正常范圍之內， 所有樣品內標擴增循環信號均在正常范圍。將濃度為200 IU/mL、2 000 IU/mL、2 000 IU/mL的質控標準品稀釋至接近檢測下限的2～5倍[5]，試驗前充分混勻，監測實驗從加樣、核酸提取到擴增的整個過程，室內質控品解凍后最好在72 h內使用完，盡可能保證質控品的穩定性，要求質控品擴增信號在預期范圍內，建立室內質控框架，觀察質控品的穩定性，對異常出現的質控值，分析其原因，陽性質控樣本失控的常見原因有：①核酸提取中的隨機誤差，如有機溶劑的去除不徹底、核酸提取中的丟失、所用耗材如離心管有 PCR抑制物、標本中擴增抑制物的殘留等;②儀器的問題，如擴增儀孔間溫度的不均一性、 孔內溫度與所示溫度的不一致性等;③試劑的問題，如探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率、Taq酶或逆轉錄酶的失活等[6]。

2.2? 室間質量評價

室間質量評價主要是將通過實驗室質量考評結果的比對，對既定項目檢驗結果的一致性、準確性進行客觀評價，了解檢測結果差異，提出針對性改進措施。目前該中心血液核酸檢測的室間質評主要是做衛生部、省臨檢中心室間質評、澳大利亞室間質評提供的相關標本， 每次參加室間質評后都對檢測結果做了及時的反饋，根據反饋結果與該室檢測結果進行對比，分析該實驗室核酸檢測結果準確性。

3? 測定后因素

3.1? 質量監控指標的建立

實驗室質量監控指標的建立符合核酸檢測實驗室質量保證指南、WS/T496-2017《臨床實驗室質量指標》、IS015189《醫學實驗室質量和能力認可準則》等規范的要求。我們實驗室目前使用的檢測指標主要有核酸和酶免陽性率、混檢陽性率、拆分陽性率、室內質控品確認的批次數和失控率、核酸檢測設備的故障率、環境監測陽性率及實驗無效率和原因分析等[6]，并依據具體情況調整各項監控指標的監測內容，確保實驗室各項檢測關鍵點均在監控范圍內。

3.2? 認真審核測定結果，進行無效原因分析

羅氏核酸檢測設備提取與擴增的自動化，提取好的核酸會通過中間的自動化連接裝置轉移到擴增檢測系統完成。羅氏核酸檢測試劑全部都是試劑盒形式，一方面減少了人為手工操作配置試劑的誤差，另一方面增加了對測定結果進行審核的要求，審核結果主要是對異常結果和擴增曲線的分析利用。如內標出現異常，靶標曲線非典型，無核酸結果，匯集與拆分項目不一致，對照品及質控品沒達到預期CT值，匯集陽性拆不出，這是否正常。對于COBASs201羅氏核酸檢測結果，反應性結果優先于其他結果，反應性結果不能被拒絕，即便IC無效，反應性pool將報告為反應性，無效IC將會使無反應性靶標結果無效。針對該科2018年1—10月間羅氏核酸檢測系統中無效原因見表1，從表1分析可以看出，導致實驗檢測無效的原因有很多，其中最為主要的是對照品的無效檢測，對此：①要加強人員操作方面的培訓，嚴格遵守正規操作流程，對照品溫和倒置混勻3次（倒置需要等待2 s），并室溫平衡30 min;不要長期開蓋暴露在空氣中。②做好對照品的抽檢及確認，試劑是否存在批間差異，試劑與質控品是否匹配。

3.3? 清潔消毒

PCR實驗強大的擴增能力和檢測的敏感性致使極其微量的污染都會導致假陽性的出現，所以PCR實驗過程中，防污染工作是一個不容忽視的問題，檢測完成后要注意環境，設備的清潔與消毒，包括：①酒精對設備、臺面、移液器、振蕩器、離心機、冰箱外及把手、生物安全柜面、進行擦拭;②酒精對空噴灑，使其可能懸浮于空氣中的核酸片段進行沉降，使其沉降于地面;③10% 84消毒液對地面、操作臺面進行擦拭;④10 min后地面用清水處理一遍、臺面用清水處理兩遍;⑤紫外燈車對操作臺面進行照射離開實驗室;⑥屋頂紫外燈按照設定好的時間自動進行照射（22：00-24：00）;⑦廢棄物處理，包括一般包裝（試劑耗材包裝）、污染類（承載標本的管類、參與標本混合的試劑、擴增產物）清潔消毒。

血液核酸檢測技術具有高度的敏感性，可大大縮短血液檢測窗口期，在提高血液安全性方面，降低輸血傳染病感染的風險有重大意義。該文就羅氏核酸檢測系統關鍵控制點做了初步討論，仍然需要不斷探索分析，只有完善質量控制，健全質量體系，才能保證核酸檢測工作準確、可控的開展。

[參考文獻]

[1]? 郭丹，王安琪，孫健，等.淺談生物樣本的質量保證與質量控制[J].中華臨床實驗室管理電子雜志，2017，5（1）：36-45.

[2]? 何成濤，馬貴明，趙靜.血站核酸檢測工作的質量控制[J].臨床血液學雜志：輸血與檢驗，2015（6）：1074-1076.

[3]? 趙宇，王艷.科華核酸血液篩查系統的質量控制[J].中國衛生產業，2017，14（3）：49-51.

[4]? 朱守兵，劉祎，章雪江，等.血液核酸篩查中的質量控制探討[J].浙江實用醫學，2015，20（5）：366-368.

[5]? 吳亞玲，祝宏，董杰，等.血液核酸篩查室內質控品濃度選擇的探討[J].中國輸血雜志，2013，26（2）：170-171.

[6]? 張妍，唐建華，李英蓮，等.核酸檢測實驗室常用質量監控指標的探討[J].中國輸血雜志，2014，27（6）：620-622.