2個荔枝品種體胚發生過程中糖含量及相關酶活性變化

吉訓志 李煥苓 王果 高兆銀 孫進華 王家保

摘? 要? 為研究糖代謝在荔枝體胚發生過程中的作用，將‘大丁香和‘新球蜜荔胚性愈傷組織接種在TD培養基上，并將‘新球蜜荔接種在TX培養基上，對比體胚誘導過程中3種胚性培養物之間淀粉、蔗糖等糖組分及其代謝相關酶活性變化，以期從糖代謝方面找出影響荔枝體胚發生效率差異的關鍵因素。結果表明：在體胚發生過程中，‘新球蜜荔在2種培養基上的淀粉含量都低于‘大丁香;三者的葡萄糖與果糖含量變化相似，但‘大丁香都高于‘新球蜜荔，而‘新球蜜荔的蔗糖含量則高于‘大丁香;‘新球蜜荔的淀粉酶、β-淀粉酶活性都高于‘大丁香，而α-淀粉酶活性相似。‘新球蜜荔的蔗糖合酶及在TD培養基上的酸性轉化酶活性高于‘大丁香，但中性轉化酶活性是以‘大丁香偏高，且‘新球蜜荔在TX培養基上也以中性轉化酶為主。由此‘新球蜜荔通過淀粉酶、蔗糖合酶及轉化酶將淀粉轉化成蔗糖為體胚發生提供物質能量，而高活性的中性轉化酶與低活性的淀粉酶，使‘大丁香的蔗糖沒有得到積累，使其體胚發生效率低于‘新球蜜荔。

關鍵詞? 荔枝;體胚發生;糖代謝;酶活性中圖分類號? S667.1? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? In order to investigate the effect of sugar metabolism on the somatic embryogenesis of litchi， embryonic callus of ‘Dadingxiang and ‘Xinqiumili were inoculated on TD medium， respectively， and the embryonic callus of ‘Xinqiumili was inoculated on TX medium. Contents of starch， sucrose and other sugar components and activities of the metabolism-related enzymes were compared among the three embryonic cultures. The results showed that starch content on TD and TX medium in ‘Xinqiumili were lower than that in ‘Dadingxiang during somatic embryogenesis. All the glucose and fructose content were similar， but glucose and fructose contents in ‘Dadingxiang was higher than that in ‘Xinqiumili， while sucrose content in ‘Xinqiumili was higher than that in ‘Dadingxiang. The activity of amylase and β-amylase in ‘Xinqiumili were higher than that in ‘Dadingxiang， but the α-amylase activity in ‘Xinqiumili and ‘Dadingxiang were similar. The activity of sucrose synthase and acid invertase on TD medium in ‘Xinqiumili were higher than that in ‘Dadingxiang， but neutral invertase activity in ‘Dadingxiang was higher than that in ‘Xinqiumili， and also the dominant by neutral invertase on TX medium in ‘Xinqiumili. Through converted the starch into the sucrose by amylase， sucrose synthase and invertase in ‘Xinqiumili was provided material energy for somatic embryogenesis， while high neutral invertase activity and low amylase activity in ‘Dadingxiang can not accumulation of sucrose， maked the efficiency of somatic embryogenesis in ‘Dadingxiang was lower than that in ‘Xinqiumili.

Keywords? litchi （Litchi chinensis Sonn.）; somatic embryogenesis; carbohydrate metabolism; enzyme activity

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.008

在植物體胚發生過程中，糖既作為能量物質提供碳源，也作為一種滲透調節劑，加大細胞內滲透壓，促進細胞吸收營養用于生長代謝。糖代謝相關酶通過對糖組分進行調控，能夠影響植物體胚發生[1]。蔗糖還作為一種信號分子在植物體胚發生過程中起調控作用。在培養基中通過添加不同濃度的蔗糖，可以調節體胚發生的能力與質量[2-3]。在植物發育的過程中，植物組織中淀粉及各種糖組分變化不同，與糖代謝相關的酶如中性轉化酶、酸性轉化酶、蔗糖合酶與淀粉酶等，其活性也是多種變化，表明糖代謝調控網絡在植物發育過程中發揮著重要作用[4]。在人參[5]、棕櫚[6]、桫欏[7]、沙地云杉[8]和楸樹[9]對其體胚發生的研究中，發現淀粉與糖含量變化與其體胚發生密切相關，但是未從糖代謝方面進一步揭示其對于體胚發生的影響，并且尚未有研究糖代謝與荔枝體胚發生關系的報道。本研究旨在通過研究糖代謝相關生理變化機制，弄清糖代謝相關酶與糖組分含量變化對荔枝體胚發生的影響，為從糖代謝方面調控荔枝體胚發生效率提供理論基礎。

筆者們前期在對2個荔枝品種胚性愈傷組織進行體胚誘導的研究中發現，‘新球蜜荔荔枝品種在TD培養基上培養第9天開始出現球形胚，在TD與TX培養基上培養第12天開始出現心形胚，兩者都在培養15～18 d中出現魚雷形胚，并且體胚大量出現，而‘大丁香荔枝品種在TD培養基上培養第15天出現心形胚，培養第18天出現畸形胚，但未見體胚大量出現[10]。本研究擬對比2個荔枝品種上述體胚發生過程中培養物的糖組分及糖代謝相關酶類變化，探討這些變化與體胚發生的關系，以期為荔枝體胚發生機制研究提供基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

挑取事先培養在含2，4-D和KT的MS培養基上的‘新球蜜荔和‘大丁香2個荔枝品種胚性愈傷組織，接種在TD培養基（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）上，再將同樣的‘新球蜜荔胚性愈傷組織接種在TX培養基（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）上，詳見表1。從開始接種在TD和TX培養基上為0 d，此后培養第6、9、12、15、18天進行取樣并進行凍存[11]。實驗重復3批次。

1.2? 方法

1.2.1? 淀粉及蔗糖、葡萄糖與果糖含量測定? 淀粉提取與測定參照賴鐘雄等[12]的方法，取待測材料0.1 g，用碘-淀粉比色法測定樣品中的淀粉含量，重復3次。

蔗糖等糖組分提取參照楊俊等[13]的方法并稍做改動：取待測材料0.5 g，加入1 mL的80%乙醇，參照上述研磨步驟，將上清液進行冷凍高壓抽干后，用0.5 mL的超純水重新溶解，于0.45 μm微孔濾膜進行過濾，-20 ℃保存備用。

色譜分離條件：色譜柱為Waters色譜柱（Xbridge Amide 3.5 mm 250 mm×4.6 mm），柱溫為30 ℃，進樣體積為10 μL。流動相：乙腈（色譜純）與超純水（含0.2%濃氨水）的體積比為75∶25，流速為1.0 mL/min，進行洗脫。蒸發光散射檢測器（3300，美國Alltech）溫度設置為80 ℃，氮氣流速為2.0 L/min，增益為2。運用empower2軟件進行儀器控制，數據收集與處理。將樣品測定出各種糖的峰面積，分別參照對應的標準曲線回歸方程，推算出樣品中各種糖含量。

1.2.2? 淀粉代謝相關酶活性的測定? 參照黃淺[14]的方法并改動。取待測材料0.1 g，加入1 mL蒸餾水，參照上述步驟研磨，制取粗酶液備用。通過測定淀粉分解成還原糖含量來表示淀粉酶活性，α-淀粉酶是事先在70 ℃水浴保溫15 min后，進行測定得到結果。β-淀粉酶活性以淀粉酶活性減去α-淀粉酶活性表示。

1.2.3? 蔗糖代謝相關酶活性的測定? 糖代謝相關酶測定參照武紅霞等[4]的方法，取待測材料0.1 g，通過測定蔗糖轉化成還原糖的含量來表示酸性轉化酶與中性轉化酶的活性，而將單糖底物反應30 min再消解后測定總糖含量來表示蔗糖合成酶的活性。

1.3? 數據處理

實驗數據利用IBM SPSS statistics 25.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），采用LSD（least significant difference）和Duncan法對處理之間以及同一處理隨時間變化的差異顯著性進行比較，并用Microsoft Excel 2010軟件制作圖表。

2? 結果與分析

2.1? 淀粉及蔗糖、葡萄糖與果糖含量變化

XQTD和XQTX的淀粉含量變化都呈不斷下降的趨勢，DDXTD的淀粉含量變化呈先下降后上升再下降的趨勢（圖1A）。XQTD的淀粉含量稍微高于XQTX，但在第18天，XQTX高于XQTD，而DDXTD在第0～6天期間低于XQTD，但從第9天開始，DDXTD急劇上升并高于XQTD。

XQTX、XQTD及DDXTD的蔗糖含量變化都呈先升后降的趨勢（圖1B）。XQTX在第6天到達峰值，而XQTD在第9天到達峰值，但XQTX高于XQTD。DDXTD在第9天到達最高，并在第6～12天的培養中均低于XQTD，但在第18天，DDXTD上升，并超過XQTD。

XQTX、XQTD及DDXTD的葡萄糖與果糖含量變化都整體呈上升的趨勢（圖1C，圖1D）。在第18天，XQTD的葡萄糖與果糖含量都高于XQTX。DDXTD是從第6天開始增長幅度變大，并且在前15 d的培養時間里都高于XQTD，但在第18天，DDXTD與XQTD差異不顯著。

2.2? 糖代謝相關酶活性變化

2.2.1? 淀粉代謝相關酶活性變化? DDXTD與XQTD的淀粉酶（AMY）與β-淀粉酶（β-AMY）活性變化都呈先升后降的趨勢，XQTX的淀粉酶（AMY）及β-淀粉酶（β-AMY）活性呈先上升后平緩的趨勢（圖2A，圖2B）。XQTX的這2種酶活性都從第9天開始高于XQTD。DDXTD與XQTD的AMY活性都在第15天達到最高，DDXTD的β-AMY則是在第12天達到最高，不過XQTD的這2種酶活性都比DDXTD高。

XQTD的α-淀粉酶（α-AMY）活性呈不斷上升的趨勢，XQTX的α-AMY活性有2個峰，

DDXTD的α-AMY活性變化呈先降后升再降的趨勢（圖2C）。在第15天，XQTX高于XQTD，而在第18天時，XQTD高于XQTX。并在第6天時，DDXTD低于XQTD，隨后DDXTD上升，并從第9天開始高于XQTD，并達到峰值，在第12～18天期間下降，第18天時，兩者的α-AMY活性差異不顯著。

2.2.2? 蔗糖代謝相關酶活性變化? XQTD的蔗糖合成酶（SS）活性變化呈先升后降的趨勢，XQTX的SS活性呈先升后降再升的趨勢，DDXTD的SS活性變化呈先升后降再升的趨勢（圖2D）。三者都在第6天到達最高點，不過XQTD的SS活性高于XQTX及DDXTD，但在第18天時，三者的SS活性差異不顯著。

XQTD的酸性轉化酶（AI）活性變化呈不斷上升的趨勢，而XQTX的AI活性有2個峰值，DDXTD的AI活性變化呈先下降后上升的趨勢（圖2E）。從第9天開始，XQTD就一直高于XQTX。在第0天時，DDXTD遠高于XQTD，但隨后DDXTD急劇下降，并低于XQTD，第15天時DDXTD的AI活性又上升，與XQTD差異不顯著。

XQTD的中性轉化酶（NI）活性變化呈先降后升的趨勢，而XQTX的NI活性呈先升后降，DDXTD的NI活性變化呈下降趨勢（圖2F）。在第9天時，XQTD的NI活性達到最低，而XQTX則是第15天出現單峰。DDXTD一直都高于XQTD。

3? 討論

糖與淀粉是植物細胞在生長發育過程中供能與儲能的重要碳水化合物，體胚發生是植物細胞脫分化和再分化的過程，而糖代謝途徑在這過程中起著為體胚發生提供物質能量的作用[15-16]。糖代謝的基本途徑是植物細胞在淀粉酶的作用下將淀粉轉化為蔗糖，蔗糖在轉化酶與蔗糖合酶的作用下進一步轉化為葡萄糖和果糖供給細胞用于生命活動，葡萄糖和果糖也能在蔗糖合酶的作用下合成蔗糖儲存起來。

在本研究中，‘新球蜜荔從9 d開始出現體胚，蔗糖合酶活性在第6天出現峰值，蔗糖含量在第9天達到峰值，而‘大丁香的蔗糖合酶與蔗糖含量都低于‘新球蜜荔，表明蔗糖含量的積累是荔枝體胚發生的前提。在12 d時，‘新球蜜荔出現心形胚結構，淀粉酶活性達到峰值，酸性轉化酶活性高于‘大丁香，蔗糖含量下降，果糖與葡萄糖含量上升，表明隨著荔枝體胚發生并進一步分化，果糖與葡萄糖作為碳骨架物質，參與了體胚結構的發育。此后‘新球蜜荔的體胚進一步發育成魚雷型胚結構，果糖與葡萄糖含量不斷上升，并且‘大丁香也開始出現體胚，兩者的糖組分含量相似，不過‘大丁香仍保持高含量的淀粉，而這可能是抑制‘大丁香體胚發生的原因之一。

花生體胚發生中在胚性細胞時期有淀粉積累高峰[17]，在柑桔體胚發生的研究中也有類似現象出現[18]。在對龍眼體胚發生的研究中發現淀粉在體胚發生早期的胚性愈傷組織階段有累積高峰，并在體胚發生過程中含量減少為其他物質合成提供物質能量[19]。這些現象與本試驗出現的情況一致，在體胚發生過程中淀粉含量，‘新球蜜荔在培養開始時就具備了高含量的淀粉，并隨著體胚發生而不斷下降，但‘大丁香的淀粉含量則是不斷上升，體胚發生少量且晚，表明淀粉在荔枝體胚發生過程中起著重要作用。在培養中，‘大丁香的蔗糖含量低于‘新球蜜荔，而果糖與葡萄糖的含量高于‘新球蜜荔，這可能與‘大丁香需要消耗大量蔗糖來增殖愈傷組織有關。而‘大丁香的淀粉酶活性低于‘新球蜜荔，中性轉化酶活性高于‘新球蜜荔，而酸性轉化酶與蔗糖合酶都低于‘新球蜜荔，表明在糖代謝過程中不同品種在體胚發生中主要起作用的糖代謝相關酶活類型不同，在轉化酶中‘新球蜜荔在TX培養基上與‘大丁香都以中性轉化酶為主，而‘新球蜜荔在TD培養基上則是以酸性轉化酶為主。這些酶造成‘大丁香與‘新球蜜荔的糖組分含量差異，可能與‘大丁香及‘新球蜜荔的體胚發生能力存在差異有關。

4? 結論

‘新球蜜荔以淀粉酶、蔗糖合酶及轉化酶的糖代謝系統，有序地對淀粉與糖組分進行正常的調控，使‘新球蜜荔體胚發生早且大量。而‘大丁香的淀粉含量則不斷上升，淀粉酶及蔗糖合酶活性也低于‘新球蜜荔，使得‘大丁香以增殖愈傷組織為主，表明淀粉含量與糖代謝相關酶活變化對荔枝體胚發生密切相關。

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