不結球白菜耐熱性評價

陳志晟 田麗波 商桑 楊衍 劉子記 鄒凱茜 曾麗萍

摘? 要? 為了構建青梗不結球白菜耐熱性評價體系并篩選出耐熱性品種，以19份青梗不結球白菜作為試材，經高溫脅迫5 d后測定幼苗的15個生長生理指標，運用主成分分析、聚類分析以及回歸分析等多元統計分析方法對各品種的耐熱性進行綜合評價。結果表明：利用主成分分析將原有的15個生長和生理指標轉化為6個獨立的綜合指標，其累計貢獻率達到83.179%;基于耐熱性綜合評價對其進行聚類分析，將19份青梗不結球白菜分為3類，第一類為強耐熱性品種：青11、青16、青13、青9、青18;第二類為中耐熱性品種：青19、青4、青7、青5、青14、青12、青15、青6、青2;第三類為弱耐熱性品種：青10、青8、青1、青3、青17。通過逐步回歸分析建立青梗不結球白菜耐熱性評價的數學模型D=-0.349-0.063×（RR）+0.163×（FW）+0.222×（SI）+0.394×（TC）+0.033×（AA）+0.137×（Pr）+0.159×（SS）-0.091× （CII），結合田間鑒定結果，青13、青11、青9、青16、青18可在海南夏秋季種植。

關鍵詞? 青梗不結球白菜;高溫脅迫;主成分分析;聚類分析中圖分類號? S634.3? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? The disease index and 15 physiological and biochemistry indexes of 19 green stem pakchoi cultivars were measured and analyzed by multivariate statistical analysis methods such as principal component analysis， cluster analysis and regression analysis to evaluate the genetic diversity of heat-resistance evaluation system of green stem pakchoi. The 15 indexes were grouped into 6 principal components with cumulative contributive rate 83.179% by principal component analysis. The varieties were divided into 3 categories based on cluster analysis of comprehensive evaluation of heat resistance would. Qing 11， Qing 16， Qing 13， Qing 9， Qing 18 were in the first category， Qing 19， Qing 4， Qing 7， Qing 5， Qing 14， Qing 12， Qing 15， Qing6， Qing 2 was in the second category， and Qing 10， Qing 8 Qing 1， Qing 3， Qing 17 was in the third category. The mathematical model for evaluating the heat tolerance of green stem pakchoi was established by stepwise regression analysis; D=-0.349-0.063×（RR）+0.163×（FW）+0.222×（SI）+0.394×（TC）+ 0.033×（AA）+0.137×（Pr）+0.159×（SS）-0.091×（CII）. Combined with field identification results， Qing 13， Qing 11， Qing 9， Qing 16 and Qing 18 can be planted in Hainan in summer and autumn.

Keywords? varieties of green stem pakchoi; high temperature stress; principal component analysis; cluster analysis

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.011

青梗不結球白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis）屬十字花科蕓薹屬白菜亞種，又稱小白菜、青菜等，是我國南方地區普遍栽種的一種重要蔬菜作物[1-2]。青梗不結球白菜適合栽種于冷涼的氣候條件，而海南地區夏季高溫環境常常使不結球白菜具有生長緩慢，死苗率高，病害嚴重等特點。目前，許多學者已從形態、生理和生化等方面對青梗不結球白菜高溫脅迫下耐熱性的鑒定指標及評價方法展開了研究，并已篩選出一些與耐熱性相關的指標[3]。早在1982年曹壽椿等[4]就對耐熱不結球白菜的株型、葉型進行了說明闡述，認為株型直立、長梗、葉小的品種耐熱且生長速度快。1991年劉維信等[5]研究了不結球白菜的耐熱性栽培以及外觀形態和高溫脅迫下生長生理的表現;2000年張玉明等[3]通過對不結球白菜的耐熱性鑒定，認為不結球白菜在高溫脅迫下葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量與對照相比呈明顯的降低，且這些指標對不結球白菜的耐熱性具有重要影響;蘇小俊[6]通過不結球白菜的夏季生長動態發現耐熱性強的品種，其根的干重、鮮重明顯高于耐熱性弱的品種;薛思嘉等[7]也認為在高溫脅迫條件下不結球白菜的單株干重、鮮重、總葉綠素含量隨高溫脅迫的加劇和時間的延長而呈現出下降的趨勢。葉陳亮等[8]在對大白菜研究中發現，耐熱性強的品種較耐熱性弱的品種在高溫環境中失水較少，束縛水與自由水之間差異大，且具有更高的游離氨基酸含量及較低的蛋白質降解速率。此外，劉燕燕[9]在對不結球白菜耐熱性鑒定的研究中發現，蔬菜作物為了適應不良環境，自身會積聚一些可溶性糖來降低細胞內的滲透勢從而適應外界不良環境。

從前人的研究報道中可以看出影響植物耐熱性是多個因素造成的，此外還涉及基因型、生理生化以及外界環境等多個層面，僅憑單個指標難以準確評判其耐熱性[10-19]。因此，羅少波等[20]通過運用統計分析與相關分析對大白菜品種的耐熱性鑒定進行分析;李丹丹等[21]利用多元方差分析和因子分析對黃瓜的耐光性進行綜合評價;張景云等[22]對小白菜進行了耐熱性分析;劉燕燕[23]等利用多元分析對不結球白菜品種的生理生化指標進行耐熱性分析鑒定。為了給海南夏秋季種植不結球白菜提供更多的科學選擇，避免單一指標評價造成的局限性，本研究通過測定青梗不結球白菜在高溫環境脅迫下的15個生長及生理指標，采用多元統計方法對高溫脅迫下19份青梗不結球白菜生長及生理指標進行綜合分析，評價各品種的耐熱性，并基于各指標與耐熱性之間的關系建立青梗不結球白菜耐熱性綜合評價的數學模型，為青梗不結球白菜的耐熱性鑒定提供依據，篩選優良的耐熱性品種，為耐熱品種的推廣提供理論參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

19份青梗不結球白菜品種名稱及來源情況詳見表1。

1.2? 方法

測定19份材料的干重、根冠比、自由水、束縛水、鮮重、壯苗指數、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、總葉綠素、游離氨基酸、蛋白質、可溶性糖、脯氨酸、熱害指數生長和生理指標。

（1）種子處理：挑選顆粒飽滿種皮完好的種子，進行溫湯浸種，在20 ℃下進行催芽，當60%的種子露白時播種于50孔育苗穴盤中，一穴一粒。在植株幼苗生長到兩片子葉伸展開時，移栽到育苗缽中，基質配方為泥炭∶蛭石∶珍珠巖的等體積比，進行常規管理。參照胡俏強等[24]的方法，當幼苗有4～5片真葉時，將長勢一致的幼苗放置在人工氣候培養箱中進行預處理2 d，晝夜溫度為25 ℃/18 ℃、光照強度為72 lx、光周期為晝夜12 h/12 h。預處理后進行高溫脅迫37 ℃/27 ℃處理，光照和光周期設置同預處理，相對濕度控制在70%～80%，高溫處理5 d，每個處理重復3次，每個重復18株，采用隨機區組排列。5 d后測定各項形態及生理指標。以25 ℃/18 ℃條件下正常生長的幼苗作為對照（CK）。

（2）鮮重測量方法為分析天平稱取植物鮮重;干重測量方法為烘干稱重法;莖桿測量方法為使用卡尺測量第一片真葉與子葉之間莖的直徑;株高測量方法為使用直尺測量整株長度;壯（3）以下指標參照李合生的實驗方法[25]，乙醇浸泡法測量葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素;考馬斯亮藍染色法測量可溶性蛋白;茚三酮比色法測量游離氨基酸、脯氨酸;蒽酮-比色法測量可溶性糖。

（4）青梗不結球白菜的耐熱性數學模型：參考周亞峰等[26]的計算方案，將耐熱性綜合評價（D值）作為因變量，以各個指標的耐熱性作為自變量，進行多元逐步回歸分析，建立耐熱性數學模型。

1.3? 數據處理

（1）相對耐熱系數：

（2）隸屬函數：鮮重等15個耐熱指標，按下列公式計算各個指標的隸屬函數。當j指標與植物的耐熱性成正相關時，用①式，與植物耐熱性呈負相關時，用②式。

式中，X表示指標，Xj的j表示第j個指標的平均值，Xmax表示第j個指標中的最大值，Xmin表示第j個指標中的最小值[19]。

（3）采用Office Excel 2010軟件整理數據，通過SPSS 21.0軟件對15個生長和生理指標進行主成分分析并得出綜合指標，以綜合指標作為評價耐熱性的基礎數據，計算得出各個品種的隸屬函數均值，即耐熱性綜合評價值（D值）并進行聚類分析和多元逐步回歸分析。

2? 結果與分析

2.1? 耐熱系數變異及各指標相關關系分析

由表2可知，各品種經過晝夜（37 ℃/ 27 ℃）高溫脅迫5 d后，幼苗的形態生理發生了明顯的變化，其相對耐熱系數明顯偏離1，干重、鮮重、束縛水、葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量與CK進行比較，都呈明顯的下降趨勢（a<1），游離氨基酸、可溶性糖、脯氨酸與CK相比都呈明顯的上升趨勢（a>1），相同指標的耐熱系數在各個樣本間均出現了較高的變異系數。從表3中可看出，熱害指數與葉綠素a、總葉綠素、可溶性糖呈現出顯著或極顯著的負相關性，脯氨酸與葉綠素b也具有顯著的負相關性，可溶性糖與葉綠素a、總葉綠素則呈現出極顯著的正相關性，總葉綠素與葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素也呈現出顯著或極顯著的正相關，自由水與鮮重呈現出極顯著的負相關。

上述結果表明，由于各指標在青梗不結球白菜中的作用各不相同，青梗不結球白菜受高溫脅迫的表現也各不相同，說明青梗不結球白菜的耐熱性是較為復雜的綜合性狀。因此，考慮到各指標之間具有的相關性，數據之間又相互重疊，僅用單個指標不能反映各個品種間的耐熱性差別，需要通過多元統計分析方法對各個指標的信息進行有效的評價。

2.2? 主成分分析

對數據進行主成分分析，在其進行標準化處理后，將多個指標轉化為少數幾個綜合指標值，能夠有效避免各指標間的相互影響。實驗對15個生長生理指標的耐熱系數進行主成分分析，選擇大于1的特征值，經過計算得出6個主成分（表4），即6個綜合指標值。各綜合指標值的貢獻率分別為27.333%、17.197%、14.939%、8.824%、7.720%、7.166%，累計貢獻率達到83.179%，當累計貢獻率大于80%說明數據是有效的，因此這6個獨立的綜合指標（comprehensive indicator， CI）CI1-CI6可以代表15個單一指標的大部分信息，可以解釋83.179%的總變異，剩余的成分可以忽略不計。

其中，第一主成分的特征向量是由植物總葉綠素（0.942）、葉綠素a（0.922）、可溶性糖（0.836）、類胡蘿卜素（0.741）、葉綠素b（0.502）、自由水（0.468）組成;第二主成分主要由脯氨酸（0.877）、游離氨基酸（0.620）、束縛水（0.606）、葉綠素b（0.591）組成;第三主成分主要由類鮮重（0.656）、干重（0.599）、束縛水（0.524）、壯苗指數（0.473）、熱害指數（0.299）組成;第四主成分主要由蛋白質（0.478）、游離氨基酸（0.284）、束縛水（0.281）、類胡蘿卜素（0.242）組成;第五主成分主要由游離氨基酸（0.517）、熱害指數（0.388）、鮮重（0.325）、類胡蘿卜素（0.289）、葉綠素a（0.232）、總葉綠素（0.219）組成;第六主成分主要由干重（0.592）、熱害指數（0.351）、類胡蘿卜素（0.248）、根冠比（0.193）、葉綠素a（0.147）、總葉綠素（0.123）組成。

2.2? 隸屬函數分析及綜合評價

以6個綜合指標作為評價耐熱性的基礎數據，經計算得出各個品種的隸屬函數均值，即耐熱性綜合評價值（D值）（表5）。某一品種的耐熱性綜合評價值進行排序過程中“青13”的D值最大，表明其耐熱性在19份供試樣品中表現最隸屬函數均值越大其耐熱性越強，在對各品種的好，“青17”的D值相對較小，在19份供試樣品中其耐熱性表現最弱。根據各品種的耐熱性綜合評價排序由高到低依次為青13>青11>青9>青16>青18>青19>青4>青7>青5>青14>青12>青15>青6>青2>青10>青8>青1>青3>青17。

2.3? 聚類分析

基于綜合評價值進行Euclidean距離的聚類分析得出如圖1所示，當綜合評價值距離為4.20時，19份青梗不結球白菜可以分為3類，第一類為強耐熱性的品種有：青11、青16、青13、青9、青18;第二類為中耐熱性的品種有：青19、青4、青7、青5、青14、青12、青15、青6、青2;第三類為弱耐熱性的品種有：青10、青8、青1、青3、青17。

2.4? 耐熱性回歸模型的構建

從實驗中的15個指標中篩選出7個對青梗不結球白菜耐熱性有顯著影響的有效指標，即根冠比、束縛水、壯苗指數、總葉綠素、游離氨基酸、蛋白質、可溶性糖、耐熱指數。對回歸方程預測精度分析，結果表明在19份青梗不結球白菜中所篩選的指標構建出來的多元回歸方程對耐熱性的預測結果與實際評價之間具有較好的一致性，說明此回歸方程可用于青梗不結球白菜的耐熱性評價。

3? 討論

熱害指數通常用于評估蔬菜作物受高溫損傷的程度，耐熱品種的熱害指數較低，反之則較高，是評價其耐熱性的重要指標[8， 27]。本研究中不結球白菜的熱害指數在高溫脅迫下均達到差異極顯著水平，可作為耐熱性評價的指標之一。不結球白菜的干重、鮮重、葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素的耐熱系數在高溫脅迫下也達到了差異顯著或極顯著水平。這與張玉明[3]和Stirbet[10]等指出的高溫脅迫會使植物體內的酶代謝失活，影響葉綠素的合成或降解，從而導致植物葉綠素含量的減少，影響植物的發育是一致的。在游離氨基酸、可溶性糖、束縛水含量中，耐熱品種因其所具有的耐熱性質使游離氨基酸、可溶性糖迅速增長，用于抵御外界高溫環境影響對自身的影響，這與婁麗娜等[1]、葉陳亮等[8]、姚遠[28]的研究也是相一致的。因此上述指標也可以作為耐熱性評價的輔助指標。此外，根冠比、自由水、壯苗指數、類胡蘿卜素、蛋白質、脯氨酸等耐熱系數的指標也達到了差異顯著或極顯著水平，也可以作為耐熱性綜合評價的參考指標。上述結果表明蔬菜作物的耐熱性機理具有多樣性。

植物的耐熱性是由多個數量性狀所決定的，它不僅與植物的基因型有關還與植物的生長生理有關，除此之外還受到環境的影響，依靠單個指標難以評價出各品種間的耐熱性差異。因此，對植物的耐熱性評價應通過多元統計分析方法，減少單一指標造成的誤差，結果才能更加合理。

作為一種重要的多元統計分析方法，主成分分析在簡化指標和綜合評價中發揮了重要作用，并在實際生產和科學研究中得到廣泛應用。例如在辣椒、黃瓜等抗逆性研究中起到了有效的篩選指標和綜合評價的作用。當前在蔬菜作物耐熱性評價中，對于該方法的利用還是存在許多差異。主要是集中在主成分分析所選用的數據不同。部分研究采用所測定指標的絕對含量值進行分析[8， 29]，但不是所有指標的絕對含量值都可以用來比較耐熱性的，同時指標的初始值之間也可能存在著不同的差異，所以選取絕對含量值來比較耐熱性可能會存在一些問題，因此本研究與目前大多數的主成分分析所選用的數據一致，即為指標的相對含量值。在計算隸屬函數的過程中，還需要運用反隸屬函數公式對部分數據進行正向化處理。若直接使用原始數據來進行綜合評價，正向指標和負向指標所反映的信息可能會抵消，從而得出錯誤的結論。因此，利用專業知識對各指標加以分析和處理是有必要的。在得出綜合評價值后，運用聚類分析將19份青梗不結球白菜劃分為強耐熱性、中耐熱性、弱耐熱性三類。說明了聚類分析在植物耐熱性綜合評價中所具有的重要意義。建立回歸方程，對品種的抗逆性進行預測，起到評價未知品種的作用。通過該方法，本研究得到了青梗不結球白菜耐熱性的數學模型，進一步篩選出耐熱性的有效指標，對于本研究中的19個品種，回歸方程的估計值與實際評估之間存在很好的相似性。另外，有效指標僅占15個生長生理指標中的一部分，雖然呈顯著或極顯著差異，但其他指標的線性顯著性較低，不能夠作為有效指標被納入數學模型中，但仍然可在實際的評價中起到輔助作用。實驗表明在植物抗逆性研究中通過多元統計分析，對各個指標進行標準化處理，有利于將復雜的問題簡單化，避免實驗數據之間的相互重疊[16， 19]。本次實驗通過15個生長和生理指標對19份青梗不結球白菜品種進行耐熱性評價，然而影響不結球耐熱性的因素還包括很多方面，例如關鍵蛋白酶的含量、抗氧化性等因素。因此，在后續的研究中可以將這些因素逐步收納進來，以期得到更加完善的數學模型和篩選出更多優秀的不結球白菜品種，為海南夏秋季種植不結球白菜提供更多的科學選擇依據。

本研究發現所選用的19分青梗不結球白菜通過聚類可分為三大類，第一類為強耐熱性品種：青11、青16、青13、青9、青18;第二類為中耐熱性品種：青19、青4、青7、青5、青14、青12、青15、青6、青2;第三類為弱耐熱性品種：青10、青8、青1、青3、青17，基本上反映了品種的耐熱性差別。建立青梗不結球白菜耐熱性評價的數學模型D=-0.349-0.063×（RR）+ 0.163×（FW）+0.222×（SI）+0.394×（TC）+0.033×（AA）+0.137×（Pr）+0.159×（SS）-0.091×（CII）可為不結球白菜的耐熱性種質資源篩選和優良新品種的培育所利用。結合田間鑒定結果，青13、青11、青9、青16、青18可在海南夏秋季種植。

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