蓮藕棒孢霉葉斑病病原鑒定及其生物學特性測定

王曉宇 李增平 鄭志淋 張宇 吳如慧

摘? 要? 對海南省海口市桂林洋蓮藕田的蓮藕植株上發生的一種新病害蓮藕棒孢霉葉斑病的病原進行了鑒定，并對病原菌進行了生物學特性測定。研究結果表明：該病原菌為山扁豆生棒孢[Corynespora cassiicola （Berk.& Curst.） Wei];病原菌菌絲生長的適宜條件為溫度25～30 ℃，pH 6～9，碳源為無水葡萄糖或D-木糖，氮源為牛肉膏或大豆蛋白胨;最適生長條件為溫度28 ℃，pH 7，碳源為無水葡萄糖，氮源為牛肉膏。光照對該病原菌的影響不大。

關鍵詞? 蓮藕;葉斑病;山扁豆生棒孢;生物學特性中圖分類號? S436.45? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? In order to identify the pathogen of leaf spot disease on Nelumbo nucifera Gaertn. and to study the biological characteristics， the samples of Corynespora leaf spot on lotus roots were collected from a lotus root field in Haikou， Hainan. The results showed that the pathogen was Corynespora cassiicola （Berk.& Curst.） Wei， the optimum temperature for mycelial growth was 25?30 ℃， and 28 ℃ was the most suitable temperature. The suitable pH was 6-9 and the best pH was 7. The mycelium of C. cassiicola grew well on the medium with anhydrous dextrose and D-xylose as the carbon sources. Peptone and beef extract was the best nitrogen source. Light had little effect on the pathogen.

Keywords? Nelumbo nucifera; leaf spot disease; Corynespora cassiicola; biological characteristic

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.017

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）屬睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬（Nelumbo Adans.）的一種重要水生植物，在我國已有3000多年的種植歷史，藥食兼用，具較高經濟價值和觀賞價值[1]。目前，隨著蓮藕連年的大面積種植，一些葉部病害已發展為蓮藕生產中的主要病害，其中蓮藕褐斑病（Pseudocercospora nympnaeacea）在湖北武漢和孝感、江西上饒和安福等地區嚴重發生，病株率一般為10%～50%，最高達80%以上[2-5]。海南省是蓮藕主要的種植區之一，2015年12月，在海南省海口市桂林洋農場蓮藕種植基地發現一種新的蓮藕葉斑病，由棒孢屬真菌引起，取名為蓮藕棒孢霉葉斑病，該病在田間發病極為嚴重，病株率達50%～90%，重病田高達100%。

國內已報道的蓮藕葉部病害有睡蓮假尾孢菌（Pseudocercospora nymphaeacea）引起的褐斑病、鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌引起的葉斑病、喜濕葉點霉菌（Phyllosticta hydrophila）引起的葉點霉葉斑病、殼二孢菌（Ascochyta sp.）引起的盤單毛孢斑枯病、喜水小菌核菌（Scle ro tium hydrophilum）引起的小核菌葉腐病、由膠孢炭疽（Colletotrichum gloeosporioides）引起的蓮藕炭疽病等[6]。2017年陳雯等[7]研究報道江蘇的蓮藕褐斑病的病原菌為山扁豆生棒孢（Cory nes pora cassiicola），但僅對此病的癥狀及發生情況進行了簡述。本研究旨在鑒定明確海南蓮藕棒孢霉葉斑病的病原菌種類并研究其生物學特性，以期為防治蓮藕棒孢霉葉斑病和進一步深入研究提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣本采集? 蓮藕棒孢霉葉斑病的樣本采自海南省海口市桂林洋發病的蓮藕田。

1.1.2? 供試培養基、試劑和設備? 供試培養基：PDA培養基參閱《植病研究方法》[8]配制，Czapek培養基參閱《植物病理學實驗技術》[9]配制。所用試劑為DNA片段回收試劑盒、Taq酶和DNA Marker，分別購自美國OMEGA公司、北京Biomed公司、大連TaKaRa公司。設備為日本Olympus BX41顯微鏡和上海京工JY600電泳儀。

1.1.3? 供試植物品種? 海南大學學生教學實踐基地內種植的蓮藕、橡膠樹、木薯、番木瓜、茄子等植株。

1.2? 方法

1.2.1? 病原分離? 采用組織分離法從發病的蓮藕病葉上分離純化病原菌：將采集的新鮮蓮藕病葉洗凈晾干，在超凈工作臺上從病葉的病健交界處剪取0.8 cm×0.8 cm大小的組織塊，先用70%酒精消毒10 s，再用0.1%升汞消毒1 min，然后用無菌水洗滌3次（每次1 min），最后將消毒好的組織塊放入PDA平板中培養3 d，挑取菌落進行純化，待產孢后進行單孢分離純化，從多個菌株中選擇一株生長良好的菌株，編號為LOBB001備用。

1.2.2? 致病性測? 采用菌絲塊接種法測定LOBB001菌株的致病性。培育5株健康蓮藕植株，先將健康蓮藕已展開的嫩葉用75%酒精進行噴霧消毒，然后用無菌束針輕輕刺破接種點表皮，挑取病原菌菌絲塊并將菌絲面朝下放置在針刺處，以同樣大小的無菌PDA塊為對照，覆蓋濕棉花后套上塑料袋保濕，24 h后移去塑料袋，每24 h觀察一次發病情況。發病后從病斑上重新分離病原菌，觀察其分生孢子形狀及菌落特征，并與接種菌株進行比較。采用相同的方法將病原菌接種橡膠樹、番木瓜、茄子、木薯等小苗的成葉以評價病原菌侵染能力。

1.2.3? 菌株鑒定? （1）形態學鑒定。在顯微鏡下觀察并描述分離病原菌的菌落特征，待分離菌產孢后，觀察病葉上的病原菌孢子，用顯微鏡對其進行拍照和測量。參考《植物病原真菌學》[10]進行形態鑒定。

（2）分子鑒定。使用OMEGA Fungal DNA Kit試劑盒提取供試真菌DNA。使用通用引物序列ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），以所提取供試真菌DNA為模板進行PCR擴增[11]。擴增產物純化、回收后，送華大基因公司進行序列測定。將所獲的序列在NCBI 進行Blast比對，并選取山扁豆生棒孢（Corynespora cassiicola）、凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）、灰梨孢（Pyricularia grisea）等8個近源物種的模式菌株序列，使用MEGA 6.0軟件進行多序列比對，采用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.4? 蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌生物學特性測定

（1）不同溫度對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌落生長的影響。在超凈工作臺里用直徑為0.5 mm的打孔器從純化備用的LOBB001菌株菌落邊緣打取菌絲塊，然后將打好的菌絲塊接種在PDA培養基平板中央，每個處理3次重復，分別置于相同條件下10、15、20、25、28、30、35 ℃的培養箱中進行恒溫光暗交替培養，每天用十字交叉法測量1次菌落直徑;連續測量9 d。

（2）不同pH對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌絲生長的影響。PDA培養基冷卻至50 ℃左右，利用1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液調節PDA培養基pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10和11制作平板培養基，用滅菌接種針挑取LOBB001菌株菌絲塊并置于平板中央，每個處理設3次重復。在最適溫度黑暗條件下進行培養，每天采用十字交叉法測量1次菌落直徑;連續測量9 d。

（3）不同碳源、氮源對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌落生長的影響。選Czapek培養基為基礎培養基。分別用等質量的無水葡萄糖、麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、D-山梨醇、蔗糖、可溶性淀粉、α-乳糖、肌醇、甘露醇和甘油替代Czapek培養基中的蔗糖，配置成不同碳源的培養基，以不加碳源的Czapek培養基為空白對照。分別用等質量的硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、草酸銨、L-天冬酰胺、牛肉膏、大豆蛋白胨和酵母浸膏置換Czapek培養基中的KNO3，配置成不同氮源的培養基，不加氮源的Czapek培養基為空白對照。將直徑5 mm的LOBB001菌株菌絲塊（PDA培養基上培養9 d）接種在不同碳源、氮源的培養基平板中央，每種碳源、氮源分別重復3次，在28 ℃恒溫培養箱培養9 d，每天采用十字交叉法測量1次菌落直徑。

（4）不同光照對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌落生長的影響。將LOBB001菌株5 mm的菌絲塊接種在PDA培養基平板中央，在相同溫度條件下分別置于完全光照、光暗交替（每12 h換1次）和完全黑暗，每種條件設3次重復，每天采用十字交叉法測量1次菌落直徑，培養9 d。

1.3? 數據處理

采用Excel 2007軟件對所得數據進行整理，并用SAS 8.1軟件進行差異顯著性分析[12]。

2? 結果與分析

2.1? 蓮藕棒孢霉葉斑病癥狀

蓮藕棒孢霉葉斑病在田間發病較為嚴重（圖1A），發病初期在葉片上出現圓形小黑點，小黑點邊緣不整齊、外圍具不明顯黃暈圈，斑點大小約為1 mm，病斑逐漸沿小葉脈擴展（圖1B）;隨后病斑擴大并變黑褐色，邊緣呈不規則形，邊緣小葉脈變黑，呈放射狀或溝壑狀向四周擴展，病斑中央為1個灰白色小圓斑，邊緣有較窄且明顯的黃色暈圈。病斑背面灰褐色，葉正面黑褐色（圖1C）;發病后期病斑變黃褐色，邊緣黃色暈圈更加明顯，潮濕條件下病斑背面長有灰褐色霉層，數個病斑擴展匯合后使葉片提早干枯（圖1D）。

2.2? 致病性測定

采用針刺法接種3 d后，接種LOBB001菌株菌絲塊的蓮藕葉片傷口變藍黑色，具明顯黃暈圈，與田間蓮藕病葉所表現的癥狀相同;而接種PDA培養基的空白對照組則無明顯變化（圖2）。從發病部位取樣進行再分離，獲得與LOBB001菌株相同的分離物，表明LOBB001菌株為該病害的致病菌。

2.3? 對其他植物的侵染性測定

在田間接種4種棒孢屬真菌在海南侵染發病嚴重的植物小苗葉片，除番木瓜老葉不發病外，番木瓜嫩葉、橡膠樹、茄子和木薯成葉均發病。表明蓮藕棒孢霉葉斑病病菌人工接種可侵染番木瓜、橡膠樹、茄子及木薯葉片，且容易侵染較嫩的葉片（圖3）。

2.4? 病原菌鑒定

2.4.1? 形態學鑒定? LOBB001菌株在PDA培養基上生長的菌落正面呈灰綠色、絨狀，具較寬的同心環帶，邊緣整齊（圖4A）。菌落背面呈墨綠色。病葉上的分生孢子梗直或彎曲，不分支，單生或叢生，淺褐色至褐色，2～10個分隔，大小為（66.79～233.27）μm×（6.89～10.03）μm，平均為139.24 μm×8.57 μm，分生孢子基部略膨大，直徑（11.07～20.81）μm，平均14.51 μm（圖4B）。分生孢子在分生孢子梗頂端單生或串生，初生分生孢子圓柱形，無色至淺色，無隔，成熟分生孢子倒棍棒狀，直或略彎，淺橄欖色或褐色。有4～18個假分隔，分隔處微縊縮或不縊縮，頂端鈍圓，基部臍點平截，加厚明顯，分生孢子大小（50.23～211.41）μm×（12.00～20.06）μm，平均為

2.4.2? 分子鑒定? 對病原菌進行ITS-PCR擴增，獲得1條約0.6 kb的清晰條帶。用引物ITS1和ITS4測序后獲得到521 nt的序列（登錄號：MH908007），將該序列在NCBI上進行BLAST比對，并構建系統發育樹，結果顯示該病原菌的rDNA-ITS序列與山扁豆生棒孢（KX755 449.1、KU564090.1）的同源性達99%（圖5），結合形態學鑒定結果，將該病原菌確定為山扁豆生棒孢[Corynespora cassiicola （Berk.&Curst.） Wei]。

2.5? 不同溫度對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌落生長的影響

不同溫度對LOBB001菌株菌絲生長的速率影響不同，病原菌在10～35 ℃內都可以生長，且菌落直徑逐漸增大，在10～28 ℃內隨溫度升高，病原菌生長速較快;28～35 ℃生長速度減慢;病原菌在25～30 ℃適宜生長，當溫度為28 ℃時生長最好，由此推斷得出病原菌的最適溫度為28 ℃（圖6）。

2.6? 不同pH對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌絲生長的影響

不同的pH對LOBB001菌株菌絲的生長影響不同;pH 2時病原菌不生長，pH 3～11病原菌都能生長，當pH 3～7時病原菌的菌落直徑大小呈逐漸上升的趨勢，當pH 7～11時病原菌大小呈逐漸下降的趨勢，因此病原菌的最適生長pH 7（圖7）。病原菌在堿性環境下生長較快，在酸性環境下生長較慢。

2.7? 不同碳源、氮源對蓮藕棒孢霉葉斑病病原原菌菌絲生長的影響

2.7.1? 不同碳源對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌絲

生長的影響? LOBB001菌株在13種碳源培養基上均可生長，但對不同碳源的利用率存在差異。

其中，無水葡萄糖和D-木糖的利用率最高，D-半乳糖的利用率次之，肌醇和甘油的利用率最低（表1）。

2.7.2? 不同氮源對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌絲生長的影響? LOBB001菌株在12種氮源培養基上均可生長，但對不同碳源的利用率存在差異。其中，牛肉膏、大豆蛋白胨的利用率最高，酵母浸膏、硝酸鈣的利用率次之，硫酸銨的利用率最低（表2）。

2.8? 不同光照對蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌菌絲生長的影響

在不同光照條件下，病原菌菌絲的生長差異不顯著，表明光照對LOBB001菌株的生長影響不大（圖8）。

3? 討論

通過對海南蓮藕棒孢霉葉斑病這一新病害病原菌致病性測定、孢子的形態特征觀察和分子鑒定，確定其病原菌為山扁豆生棒孢[Corynespora cassiicola（Berk.&Curst.）Wei]。生物學特性測定表明：蓮藕棒孢霉葉斑病病原菌是一種多寄主真菌，人工接種易侵染番木瓜、橡膠樹、木薯、茄子較嫩的葉片;在28 ℃、pH 7、以牛肉膏為混合氮源或以硝酸鈣為氮源、無水葡萄糖為碳源時菌落生長最好，光照或黑暗條件對其生長無明顯影響。

山扁豆生棒孢[Corynespora cassiicola（Berk.&Curst.）Wei]可為害植物的葉片、莖、花、果實和根部，已報道侵染橡膠、番茄、黃瓜、茄子等300多種植物，并造成嚴重的經濟損失[13-14]。肖敏等[15]報道引起節瓜褐斑病的山扁豆生棒孢的最適生長溫度為30 ℃，最適pH 6，光照對該菌的生長有影響，以黑暗條件下生長最快，最適碳源為D-甘露醇和蔗糖，最適氮源為蛋白胨。這與本研究的結果差異較大。秦人全等[16]報道引起木棉褐斑病的山扁豆生棒孢在28 ℃、pH 6、麥芽糖和硝酸鈉為碳氮源時生長最好，光照對該菌的生長沒有影響，與本研究結果基本相同。張賀等[17]報道橡膠樹棒孢霉落葉病的山扁豆生棒孢在28 ℃、pH 7、麥芽糖和蛋白胨為碳氮源時生長最好，光照對該菌的生長沒有影響，這與本研究的結果基本相同。造成不同寄主上的山扁豆生棒孢生物學特性存在差異的原因，可能是為害不同寄主的山扁豆生棒孢菌株之間存在一定差異。

田間調查發現，海南蓮藕棒孢霉葉斑病在每年7月開始發生，8月中下旬進入發病高峰，蓮藕收獲后病菌通過風雨傳播侵染田間殘留蓮藕新抽的嫩葉進行越冬存活，這與陳雯等[7]報道由山扁豆生棒孢引起的蓮藕褐斑病，在高濕、連續陰雨條件容易發生相一致。病菌的分生孢子可直接侵入并為害蓮藕嫩葉。建議海南省在蓮藕生產中可在每年7月初病害初發期選用對棒孢屬真菌防效較好的多菌靈、甲基托布津等農藥進行噴霧防治[3， 7]。

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