2株高產蛋白微藻細胞代謝物的比較

李貴麗 魏曉奕 周偉 李積華 韓志萍

摘? 要? 以2株新近分離出來的鏈帶藻（Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74）為研究對象，檢測胞內主要細胞代謝產物組成及含量變化，找出優勢細胞代謝產物。收集相同時間間隔下培養的2株微藻，經過凍干、研磨、復溶，制備成細胞溶解液，再進行逐級萃取，分級檢測每個萃取步驟中所得細胞代謝產物的含量。結果表明：在BG11培養基中生長30 d，鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的最高蛋白含量分別達到細胞干重的71.68%和62.14%，其他代謝產物，如碳水化合物、脂質和色素，在2株微藻中的含量都沒有超過20%。對比其他微藻的文獻報道，鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96是目前發現的蛋白含量最高的藻株，其蛋白的表達模式和蛋白相關產品的開發具有研究價值。

關鍵詞? 鏈帶藻;代謝產物;蛋白;脂質中圖分類號? Q949.2? ? ?文獻標識碼? A

Abstract? To reveal the dominant cell metabolites， as well as their contents， including carbohydrates， lipids， proteins， chlorophyll and carotenoid of two newly isolated microalgae （Desmodesmus sp. QL96 and Desmodesmus sp. QJ74）. Two microalgae were collected at the dedicated culture time， the cells were lyophilized， ground and resuspended to prepare a cell lysate， and then subjected to stepwise extraction and fractionation to detect the content of the cell metabolite obtained in each extraction step. The results showed that the protein content of Desmodesmus sp. QL96 and Desmodesmus sp. QJ74 reached up to 71.68% and 62.14% of the cell dry weight which were grown in the BG11 medium for 30 days， respectively. The contents of other cell metabolites were much lower， none exceeding 20% of the cell dry weight. Compared to other microalgae in literatures， Desmodesmus sp. QL96 is the most protein abundant microalgae and deserves further study， including protein expression patterns and protein-sourced product development.

Keywords? Desmodesmus sp.; metabolites; protein; lipid

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.024

微藻是單細胞微生物，和其他微生物一樣，只有利用顯微鏡才能分辨其形態特征[1]。微藻種類多樣，已經分離鑒定的微藻種屬有螺旋藻、小球藻、杜氏藻、紅球藻等幾萬種[1-2]。微藻繁殖速度快、和植物一樣可以進行光合作用，是自然界中光合效率最高、生長最為迅速的原始生物種類之一[3]。其細胞代謝產物包括多糖、蛋白質、脂肪酸、色素等多種生物質成分[3]，這些成分的開發利用研究近年來已逐漸成為熱點，例如以微藻脂質為原料的生物柴油[4]、以微藻蛋白為主要原料[5]、微藻多糖為主要功效成分的保健品等產品[6-7]的開發研究。然而這些開發項目大多停留在初級階段，在產業中的應用十分有限，其原因主要是經濟成本較高，而經濟成本和微藻代謝產物含量的高低直接相關。獲得高產生物成分微藻的途徑一般有兩個，一是篩選天然高產微藻，二是通過基因工程技術提高微藻細胞中部分生物成分的產量。一些通過基因技術建立的工程藻，在實驗室生長狀態良好，在開放池塘卻顯示了諸多不適[8]，因而篩選天然高產微藻更加具有可行性。

相關研究發現一些鏈帶藻具有較好的環境適應性，如在新疆沙漠地區分離得到耐干旱的富油鏈帶藻Desmodesmus sp. XJ842[9]，臺灣高濕熱地區分離得到的高產油能力的鏈帶藻Desmodesmus sp. F2等，這些鏈帶藻對惡劣環境的適應力近年來吸引了廣泛的關注。本文以新近從我國西藏高原和云貴高原地區分離出來的2株鏈帶藻為研究對象，以鹽水BG11為培養基，利用各種方法檢測了藻株細胞中的主要組分，以挖掘其潛在的開發前景和應用領域。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.2? 方法

1.2.1? 微藻培養? 微藻培養基選用BG11基礎培養基[10]。無菌操作條件下，在250 mL的三角瓶中裝入100 mL培養基，接入5×107個微藻細胞，在溫度（25±1） ℃、光照強度8000 lx、光暗周期12 h∶12 h的培養條件下培養30 d。在設置的時間點上，將微藻通過抽濾的方法收集后再真空冷凍干燥[11]，獲得干藻粉，于?20 ℃儲存直至測定分析[12]。

1.2.2? 生物量的測定? 微藻接種后每隔3 d，從每個培養液中抽取10 μL，用血球計數板計數測定Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的細胞數變化情況，剩余的培養液經抽濾和凍干后測細胞干重，繪制2株鏈帶藻的生長曲線。

1.2.3? 主要細胞代謝產物的測定? 接種后每隔6 d收集一次微藻，凍干后于研缽中磨碎，復懸于25%的甲醇氫氧化鈉溶液和pH 7.4的磷酸鹽緩沖液混合液（74∶1，V/V）[12-13]，制備細胞溶解液，用以測定其中的總糖、蛋白、脂質、葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

總糖含量測定：參照Chen等[12]的方法，取上述溶解液0.6 mL，加入1.2 mL經過4 ℃預冷的75% H2SO4，渦旋混合2 min，繼續加入2.4 mL蒽酮試劑，于沸水浴下15 min后，迅速冷卻至室溫，于578 nm下測定吸光度?？瞻讓φ杖?.6 mL溶解液加入3.6 mL經過4 ℃預冷的75% H2SO4，不加蒽酮試劑測定吸光度。以D-葡萄糖為標品繪制標準曲線。

總蛋白含量測定：蛋白含量以考馬斯亮藍法進行測定[14]。即取500 μL溶解液，于沸水浴25～30 min后，迅速冷卻至室溫，加入5 mL考馬斯亮藍染液，震蕩2 min，混勻后于595 nm下測定吸光度。以BSA為標品繪制標準曲線。

色素含量測定：按Chen等[12]的方法并進行了適當修改，即取溶解液8 mL于沸水浴25～30 min后迅速冷卻至室溫，與12 mL氯仿甲醇溶液（2∶1，V/V）混合，渦旋混合2 min，離心，取上層水相于416和453 nm測定吸光度，按照公式（1）和（2）分別計算葉綠素a和葉綠素b的含量。取下層有機相于480和430 nm測定吸光度，根據公式（3）計算類胡蘿卜素含量。

脂質含量的測定：參照Chen 等[12]的方法，取色素含量測定步驟中分離得到的有機相2 mL，加入1 mol/L三乙醇胺∶1 mol/L乙酸∶6.45%硝酸銅混合液（9∶1∶10，V/V/V）2 mL，渦旋混合2 min，于10000 r/min離心2 min，取下層有機相于260 nm下測定吸光度。對照樣本中加入1 mol/L三乙醇胺∶1 mol/L乙酸（9∶1，V/V）2 mL，不添加硝酸銅成分，以棕櫚酸為標品繪制標準曲線。

1.3? 數據處理

微藻培養的每個預設的時間點都設置3個獨立的平行培養，收集的每個樣品都進行3次平行的分析檢測。采用 Excel 2007和 Origin 8.5軟件進行數據分析與圖形繪制。

2? 結果與分析

2.1? 生長曲線的測定

細胞中蛋白含量隨時間變化呈一定的波動性（圖2B），總的來說在微藻細胞干重的40%～75%。Desmodesmus sp. QL96的蛋白含量隨培養時間的延長呈凹字形變化，在接種后第12～24天，蛋白含量處于平緩的低谷，第6和30天的蛋白含量較高，分別是0.717 mg/mg和0.678 mg/mg。Desmodesmus sp. QJ74的蛋白含量變化呈明顯的波浪形，在第6、18和30天時較高，而在第12天和第24天時較低，在0.463～ 0.621 mg/mg范圍內變化。

2株藻細胞中脂質含量變化趨勢如圖2C所示，Desmodesmus sp. QL96脂質含量隨培養時間延長呈現先上升后下降的趨勢，且在培養12 d后Desmodesmus sp. QL96脂質含量達到0.157 mg/mg，之后逐漸下降，而Desmodesmus sp. QJ74中脂質含量始終呈現逐漸下降趨勢，從第18天起，2株藻的脂質含量均在0.10 mg/mg左右，在第30天時約為0.086 mg/mg。

Desmodesmus sp. QL96中葉綠素A和B的含量都隨培養時間的延長而增加（圖2D、圖2E），其中葉綠素A的含量在培養第6天時為0.010 mg/mg，每天長勢較均勻，在第30天時達到0.023 mg/mg，葉綠素B在0～18 d長勢較好，之后在達到0.004 mg/mg后水平保持穩定。Desmodesmus sp. QJ74中葉綠素A的含量隨培養時間的延長從0.012 mg/mg降到了0.007 mg/mg（圖2D），葉綠素B的平均含量呈現先下降后緩慢上升的趨勢，最低為0.002 mg/mg （圖2E）。

類胡蘿卜素在Desmodesmus sp. QL96中隨時間呈現先增后降的趨勢（圖2F），在第18天達到最大，為0.004 mg/mg，而其在Desmodesmus sp. QJ74的細胞溶解液中沒有檢出。

2.3? 細胞主要代謝產物

對細胞主要代謝成分的檢測主要參照Chen等[12]的方法，通過制備細胞溶解液、逐級萃取、分級檢測的路徑，檢測了對數中期（第12天）中每個萃取步驟中所得產物的含量，繪制了細胞代謝產物總圖（圖3）。

從圖3中可見，鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74在BG11培養基中25 ℃下生長的主要細胞代謝產物是蛋白質，其含量分別占2株藻細胞干重的56.65%和45.97%。其次是脂質，其含量約占細胞干重的10.50%和11.20%，碳水化合物含量約占細胞干重的7.64%和7.70%。其他細胞代謝物，如葉綠素、類胡蘿卜素的含量均小于2.5%。

3? 討論

本文研究了新近分離出來的鏈帶藻Des

Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的主要細胞代謝物都是蛋白質，在生長的對數中期（第12天），其蛋白含量分別占細胞干重的56.65%和45.97%（圖3），然而Desmodesmus sp. QJ74的生物質產率較低（圖1），因而總體來說，Desmodesmus sp. QL96的綜合蛋白產率更高。其最大蛋白產率0.717 mg/mg（圖3B），超過了現有報道中蛋白含量較高的小球藻C. vulgaris（0.6 mg/mg）[19]和極大螺旋藻Spirulina maxima（0.7 mg/mg）[20]。Desmodesmus sp. QL96中的蛋白含量隨培養時間呈現先下降后上升的趨勢（圖2B），而生物質產率/細胞數目則呈現先上升后平緩的趨勢（圖1），說明細胞增長的過程消耗了細胞內部的蛋白，這可能是由于細胞自身合成的蛋白酶水解了部分蛋白，也可能是細胞代謝過程中消耗了部分蛋白[11]，其中的分子機理仍需進一步研究。

脂類物質是鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74細胞中含量第二的成分（圖2），然而在2株藻的含量都少于20%（圖3C），再者是碳水化合物，而其他組分如葉綠素、類胡蘿卜素等的含量均很少。其碳水化合物的含量與同科的冬生柵藻接近[21]，但均低于小球藻[22]、鹽生杜氏藻[14]和其他的球綠微藻[14]。

4? 結論

新近分離出來的鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96蛋白含量可達細胞干重的71.68%，是目前報道的所有微藻中蛋白含量最高的藻種。Desmo-

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