多效唑對芒果園土壤細菌多樣性的影響及PICRUSt基因功能預測分析

靳曉拓 周彥妤 夏楊榮暢 陳麗君 李濤 趙洪偉

摘? 要? 為了探究多效唑對芒果園土壤微生物多樣性和群落結構的影響，本研究以海南樂東某芒果園為研究對象，設置施用和不施用多效唑的土壤分別為處理組和對照組，通過Illumina Miseq測序平臺對芒果園土壤進行16S rRNA高通量測序分析。2組樣品通過高通量測序共得到3586個OTUs（operational taxonomic units），可注釋到38個門、89個綱、195個目、378個科、673個屬、1353個種。Alpha多樣性分析表明，施用多效唑后，土壤細菌豐富度指數顯著高于同時期未施用多效唑的土壤;但施藥后土壤的細菌多樣性顯著降低。主成分分析表明，施用多效唑對土壤細菌的群落結構產生影響。與對照組相比，施用多效唑的土壤中變形菌門和浮霉菌門等含量顯著增高，而放線菌門和厚壁菌門等含量顯著降低。PICRUSt功能預測分析結果表明，芒果園土壤細菌主要涉及細胞生長與死亡、碳水化合物代謝、次生產物代謝的生物合成、氨基酸代謝等43個子功能，表現出功能上的豐富性。多效唑處理后，會降低土壤細菌的整體代謝能力。由此可見，施用多效唑會降低土壤細菌的多樣性，改變土壤細菌的相對豐度，且對土壤細菌的功能會有一定的影響。

關鍵詞? 多效唑;芒果園;土壤;細菌多樣性;PICRUSt分析中圖分類號? S154.3;X592? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? The Illumina Miseq 16S rRNA high-throughput sequencing technology was used to study the bacterial community structure and diversity of two group soil samples with and without paclobutrazol treatment， respectively， from a mango orchard in Ledong， Hainan. A total of 3586 operational taxonomic units （OTUs） in two groups were obtained， which were classified as 38 phylums， 89 classes， 195 orders， 378 families， 673 genera and 1353 species. The results of the analysis of Alpha diversity showed that soil bacterial richness index was significantly higher in the paclobutrazo-treated soils， however compared with the soils without paclobutrazol treatment， the bacterial diversity was significantly decreased. The principal component analysis indicated that the community structure of soil bacteria was affected by paclobutrazol. The quantities of Proteobacteria and Planctomycetes were significantly increased in the paclobutrazol-treated soils， however， those of Actinobacteria and Firmicutes were significantly decreased. The PICRUSt analysis showed that the functional gene families were mainly related to 43 sub-functions including the cell growth and death， carbohydrate metabolism， biosynthesis of secondary metabolites， amino acid metabolism， and so on. The total metabolic capacity of soil bacteria could be reduced after treated with paclobutrazol. Therefore， the application of paclobutrazol can reduce the diversity of soil bacteria， and it also has some impacts on the relative abundance and functions of soil bacteria.

Keywords? paclobutrazol; mango orchard; soil; bacterial diversity; PICRUSt analysis

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.027

我國是芒果原產地之一，近些年芒果的種植面積不斷擴大，產量逐年增加，已成為一些地方的農業支柱產業[1]。隨著芒果產業的大規模發展，其生產過程中農藥的不合理使用問題日益嚴峻。多效唑是一種三唑類植物生長調節劑，在芒果園土壤中有較大的施用量，主要用在芒果樹的控梢、提高芒果產量[2-4]等方面。但多效唑在土壤中的殘留期較長，其半衰期在半年到一年[4]，土壤中殘留的多效唑可能會影響土壤生態系統的平衡[5]。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分[6]，土壤微生物可以敏感地反映土壤環境質量的變化，同時是土壤中生物活性的具體體現[7]。微生物與土壤健康狀況的關系密切，對生態系統的能量流動和物質循環具有重要作用[8]。土壤中微生物以細菌數量最多，占土壤微生物總量的70%以上，細菌群落中含有大量具有特殊功能的生理類群，如固氮菌、氨化細菌、硝化細菌等[9]。細菌種類或豐度的變化，會對這些特定生理類群的數量產生直接影響，從而影響土壤肥力，如放線菌對植物病蟲害防治有著重要的作用[10]。并且農藥的施用會對土壤微生物產生一定的影響，從而影響農業生產。

目前關于土壤微生物多樣性的研究多采用傳統的平板培養法[11-14]，但平板培養法具有較大的局限性，通過傳統的培養方法得到的微生物只占環境微生物總數極少的一部分[15]。隨著分子生物學和生物信息學的發展，PCR-SSCP[16]、PLFA[17]、DGGE和高通量測序技術[18-20]等一些新的方法在土壤微生物的研究中得到應用。其中，高通量測序技術可以避免微生物分離培養的過程，能夠準確、快速、高通量地解讀土壤微生物生態系統的變化情況，與其他方法相比，具有通量大、準確率高、成本低等優點[21]，更加適合土壤微生物群落結構和多樣性的分析。目前利用高通量測序的方法研究土壤微生物的報道有很多，但是，尚未有通過高通量測序的方法研究多效唑對土壤微生物多樣性影響的報道。同時，傳統的方法無法對微生物的功能進行研究，16S rRNA高通量測序可以通過PICRUSt（phylo genetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件預測基因序列對應的細菌菌群代謝功能譜。PICRUSt功能預測分析相較于宏基因組研究更加方便且成本也更低，同時預測效果具有較高的可靠性[22]。目前該方法已在珊瑚礁[23]、海水[24]、庫區[25]、土壤[26-28]等不同生境中得到良好的應用，而關于多效唑對芒果園土壤微生物的研究還未見報道。

海南是我國主要的芒果種植區，據《2017年海南省統計年鑒》，樂東黎族自治縣的芒果種植面積達到10 341 hm2，位居海南省第二。本研究以海南省樂東黎族自治縣黃流鎮某芒果園為研究對象，通過高通量測序技術研究了施用多效唑前后芒果園土壤微生物多樣性及其群落結構的變化情況，結合PICRUSt分析預測多效唑對芒果園土壤微生物功能的影響，為合理施用多效唑和評價多效唑對農田土壤生態系統的影響提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 土壤樣品采集與處理

土壤樣品采集參照《土壤農化分析》[29]，在處理前后試驗組和對照組各設置3個采樣區域，去除表層土壤，每個采樣區采集6～8個點的土壤混勻，放置冰盒中帶回實驗室儲存于?80 ℃冰箱，用于DNA提取及細菌16S rRNA測序分析。

1.2? 試驗設計

試驗基地位于海南省樂東黎族自治縣黃流鎮某芒果園。該地區屬于熱帶季風氣候，土壤為砂質壤土，光熱充足，年平均氣溫為25 ℃，年降雨量為1400～1800 mm。在基地內選取未使用過多效唑的幼齡芒果樹區域，設置試驗組（T）和對照組（C），試驗組施用多效唑量為1.5 g/m2（以多效唑有效成分計），分多效唑施用前（T0）和施用后30 d （T30）2個時期進行樣品采集;對照組采樣時期同試驗組，分為C0和C30 2個時期。試驗前土壤基本參數如表1所示。

1.3? 檢測方法

土壤DNA采用MOBIO土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil? DNA Isolation kit）進行提取，細菌PCR擴增采用V4-V5可變區的細菌通用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和907R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）。PCR擴增體系及擴增條件參照文獻[30]進行。土壤DNA樣品經過PCR質量驗證合格后，送至廣州賽哲生物科技股份有限公司利用Illumina Miseq測序平臺進行16S rRNA序列測定。

1.4? 數據處理

采用FLASH v1.2.7軟件進行序列拼接，對拼接得到的序列進行過濾。采用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據。測序得到的序列經拼接過濾后，提交到美吉云平臺進行數據處理分析。采用SPSS 24.0軟件對數據進行差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? 樣品信息統計

通過Illumina高通量測序平臺對芒果園土壤細菌16SrRNA 的V4-V5區進行序列測定，12個樣品測序共獲得454 320條原始序列，經過濾后共產生445 976條有效序列，每個樣品至少產生36 557條有效序列，平均產生37 165條有效序列。對測序結果基于97.00%的相似度進行聚類，共得到3586個OTUs。

根據樣品稀釋曲線可以看出，12個樣品的曲線均有趨于平坦的趨勢（圖1），表明樣品測序量合理，OTUs的覆蓋度高，測序深度可以滿足試驗要求。

采用Venn圖2展示4組樣品所含OTUs，4組樣品共有的核心OTUs個數為1841個。C0共有2468個OTUs，C30共有3143個OTUs;T0共有2439個OTUs，T30共有2877個OTUs。4組樣品中的細菌在OTUs水平上存在差異;施用多效唑后，土壤中總物種類別和特有物種類別減少。與對照組（C30）相比，經多效唑處理后（T30），土壤中OTUs個數減少。

2.2? Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可用來反映樣本中微生物的豐度和多樣性。采用群落豐富度指數Sobs、Ace和Chao以及群落多樣性指數Shannon和Simpson對施用多效唑后芒果園土壤細菌多樣性和群落結構的變化情況進行評估，結果見表2。結果表明，試驗樣品具有豐富的群落組成，施用多效唑后，樣本細菌群落豐富度和多樣性有顯著的變化。C0和T0的豐富度指數和多樣性指數沒有顯著差異。但T30的群落豐富度指數Ace顯著高于C30，T30的物種多樣性指數Shannon和Simpson顯著低于C30。Ace指數越大，表明土壤中細菌的數目越多;多樣性指數越大，表明土壤中每個物種的個數越平均，物種分布越均勻。施用多效唑后，土壤細菌總數目增多，但各物種的數目差異較大，不同種類的細菌分布不均勻。

2.3? 物種組成分析

將測序得到的3586個OTUs與silva128/16s_ bacteria物種分類數據庫進行比對，可注釋到38個門、89個綱、195個目、378個科、673個屬、1353個種。在門水平上對細菌群落結構組成進行分析，結果表明樣品豐度大于1%的有變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）以及1個未分類菌門（unclassified k-norank），這10個細菌門為樣品土壤中的優勢菌群。施用多效唑的土壤T30和對照組C30在細菌門的相對豐度有了明顯的變化，而C0和T0在細菌門水平上的相對豐度沒有顯著差異，說明所選試驗區域的對照組和試驗組土壤細菌無顯著差異（圖3A）。施用多效唑的土壤T30中，變形菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門和硝化螺旋桿菌門等的相對豐度顯著高于對照組土壤C30;放線菌門和厚壁菌門的相對豐度顯著低于C30（圖3B）。

2.4? Beta多樣性分析

Beta多樣性分析是通過微生物群落構成的比較，考慮物種豐度和均勻度，評估不同微生物群落間的差異情況。主成分分析（PcoA）用來反映不同處理樣本群落組成的相似性或差異。在屬水平上對物種豐度進行主成分分析，在第一個時期，C0與T0的距離較近，表明試驗進行前C組和T組樣本組成較為類似;在第二個時期，T30與C30的樣點較為分散，在圖中的距離較遠，表明經多效唑處理后土壤的細菌群落結構有了較大的改變（圖4）。

2.5? PICRUSt功能預測分析

為了探究施用多效唑后土壤細菌的功能變化情況，本研究采用PICRUSt軟件進行菌群預測分析。基于KEGG數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）預測的結果表明：在一級功能層共獲得6類生物代謝通路功能分析：代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、環境信息處理（environmental information processing）、細胞過程（cellular processes）、有機系統（organismal systems）和人類疾?。╤uman diseases）。其中代謝、遺傳信息處理和環境信息處理為其主要組成，占比分別為51.73%～52.36%、15.28%～15.39%和13.11%～13.71%。

同時對預測基因二級功能層進行分析，發現其由細胞生長與死亡（cell growth and death）、折疊、分類和降解（folding，sorting and degradation）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、次生產物代謝的生物合成（biosynthesis of other secondary metabolites）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）等43個子功能組成。對二級功能層預測基因拷貝數進行分析，發現T30 和C30共有25個二級功能層預測基因的拷貝數存在顯著差異（圖5）。施用多效唑的處理組T30中有細胞生長與死亡（cell growth and death）、折疊、分類和降解（folding，sorting and degradation）、內分泌代謝疾?。╡ndocrine and metabolic diseases）、細胞運動（cell motility）、膜運輸（membrane transport）、能量代謝（energy metabolism）、循環系統（circulatory system）、輔助因子和維生素的代謝（metabolism of cofactors and vitamins）、全局和概覽地圖（global and overview maps）、免疫系統（immune system）和傳染病：細菌（infectious diseases： Bacterial）11個子功能預測基因的拷貝數大于空白對照組C30;T30中的碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、次生產物代謝的生物合成（biosynthesis of other secondary metabolites）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、神經系統（nervous system）、多糖生物合成和代謝（glycan biosynthesis and metabolism）、運輸和分解代謝（transport and catabolism）、免疫系統疾?。╥mmune diseases）、物質依賴（substance dependence）、類脂化合物代謝（lipid metabolism）、傳染?。杭纳╥nfectious diseases： Parasitic）、心血管疾?。╟ardiovascular diseases）、環境適應（environmental adaptation）、排泄系統（excretory system）和內分泌系統（endocrine system）14個子功能預測基因的拷貝數小于C30。

3? 討論

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，在生態系統的物質和能量循環中起著不可或缺的作用。土壤中大部分的生物化學轉化過程是微生物活動引起的，凡能改變微生物數量或活性的任何化合物都會影響土壤的生化過程，最終影響土壤肥力和植物生長[31]。農藥的施用會對土壤微生物產生一定的影響，施用農藥后，土壤環境會發生變化，土壤微生物之間的穩定性、土壤微生物的生物量及活性會降低。目前，關于農藥對土壤微生物影響的研究日益增加，目前的報道有有機磷類[32]、有機氯類[33]和三唑類[11-14， 34-35]等。

現有關于多效唑對土壤微生物的影響的研究報道多采用平板培養法進行，趙秀芬等[11]、袁志華等[12]、Gon?alves等[13]、Silva等[14]等均采用此方法研究了多效唑對土壤微生物多樣性、生物量的影響，由于試驗方法的限制均未對土壤細菌群落組成進行研究。本研究采用高通量測序技術研究了多效唑對芒果園土壤細菌的影響，發現施藥后的土壤細菌多樣性顯著降低，這與前人[11， 13-14]的研究結果一致。Alpha多樣性分析表明施用多效唑后，土壤細菌的豐富度降低，與Silva等[14]的報道一致;細菌群落多樣性降低，這可能與多效唑減少了芒果園中土壤細菌的種類有關。本研究的結果與Kuo等[36]的研究結果一致，與同時期未施用多效唑的芒果園土壤相比，施用多效唑的土壤細菌群落結構有了較大的改變。通過物種群落組成分析，發現多效唑對土壤中變形菌門和放線菌門的細菌影響最大，施用多效唑后，土壤中變形菌門的豐度顯著提高，放線菌門的豐度顯著降低，放線菌對植物病害具有十分明顯的防治作用，放線菌含量的降低可能會導致植物病害發生[10]。本研究結果表明施用多效唑會減少土壤細菌的物種種類，打破土壤微生態平衡，可能使原本供給某類細菌的養分被其他細菌利用，增大了其他細菌的數量，雖然提高了土壤中細菌總體的豐富度，但減少了土壤中的細菌種類，導致土壤的細菌多樣性降低。

之前關于多效唑對芒果園細菌群落結構的研究主要關注土壤微生物量的變化情況，對其功能的研究開展較少。農藥殘留會使土壤中的功能微生物含量發生改變，具有降解污染物功能的微生物含量增多[37-39]。PICRUSt分析通過與數據庫比對，將微生物的變化情況和生物功能聯系起來[40]。施用多效唑前后土壤微生物的相對豐度發生改變，其功能也發生相應的變化，本研究將高通量測序結果進行PICRUSt功能預測分析，發現施用多效唑后，在一級功能層和二級功能層的預測基因拷貝數整體趨勢低于對照組。該結果初步揭示了施用多效唑后芒果園土壤細菌功能的差異，但鑒于PICRUSt功能預測分析的局限性，后續需要結合宏基因組測序等技術進一步分析。

4? 結論

本研究初步探明了施用多效唑后芒果園土壤細菌多樣性和群落結構的變化情況，施用多效唑會減少土壤OTUs的數目，降低土壤細菌的多樣性;多效唑會改變芒果園土壤的細菌相對豐度，施用多效唑后，變形菌門的豐度顯著提高，放線菌門的豐度顯著降低;通過PICRUSt功能預測分析，發現施用多效唑后，土壤細菌的功能有一定的改變，土壤的預測基因拷貝數在一級功能層和二級功能層上均低于對照組。本研究采用高通量測序技術研究了多效唑對芒果園土壤微生物的影響，對評價多效唑對芒果園土壤微生物生態系統的影響進而指導合理施用多效唑具有重要意義。

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