茶小綠葉蟬危害烏龍茶茶樹品種的揮發物分析

金珊 韓李偉 葉乃興 王蔚 黃伙水 劉偉

摘? 要? 為明確茶小綠葉蟬危害不同抗性茶樹品種后揮發物的變化，從而為抗蟲茶樹品種的選育提供依據，本研究選擇小綠葉蟬危害蟲口密度最大和最小的烏龍茶茶樹品種肉桂和鐵觀音為材料，以GC-MS為研究手段，進行茶樹組成型和蟲害誘導型揮發物的測定和分析。結果表明，鄰異丙基苯甲烷、-羅勒烯、反式--羅勒烯、-法呢烯、-萜品烯和3-甲基-2-環己烯-1-酮為鐵觀音和肉桂的主要組成型揮發物成分。2個品種在健康茶樹揮發物的成分組成和各組分的含量上都存在差異。芳樟醇只在鐵觀音的健康茶梢中被檢測到，而十三（碳）烷、乙酸辛酯、十六烷和雪松醇只在肉桂的健康茶梢上檢測到。-月桂烯、-羅勒烯、反式--羅勒烯和-法呢烯在鐵觀音上的含量遠遠大于肉桂。另一方面，茶樹受小綠葉蟬危害一段時間后，鐵觀音和肉桂在揮發物組成和含量上產生了較大的變化。二者都釋放大量的-月桂烯、-羅勒烯、反式--羅勒烯、-法呢烯和芳樟醇，在危害4 h和8 h的揮發物測定中，2個品種的這些成分較危害前的增加量從1.49倍到41.22倍。此外，茶小綠葉蟬的危害還誘導了新的揮發物的產生，包括（Z）-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯和苯乙醇。（Z）-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯、苯乙醇、-月桂烯、-羅勒烯、反式- -羅勒烯、-法呢烯和芳樟醇，這10種揮發性物質可能跟茶樹的誘導抗性和鐵觀音的抗蟲性有關。

關鍵詞? 茶樹;茶小綠葉蟬;揮發物;抗性

中圖分類號? S31? ? ? 文獻標識碼? A

在漫長的協同進化中，植物發展了一套完整的防御系統來抵御植食性昆蟲的侵害，包括植物先天具有的組成抗性和在遭受植食性昆蟲危害后植物所產生的誘導抗性[1]。其中組成抗性是植物體內固有的，跟自身基因型有關，具有全株性，且貫穿植物一生并始終起作用，如植物自身的外部形態結構和內部組織結構以及部分代謝物質對植物性昆蟲的影響。誘導抗性具有開-關效應，是一種類似于免疫反應的抗性現象，如植物在受到植食性昆蟲侵害誘導所產生的一些代謝物質，這些物質對植食性昆蟲及其天敵產生有害或有益的影響作用。組成抗性相對固定，而誘導抗性是一種應激反應，具有明顯的時空效應[2-3]。近年來，寄主的揮發物是植物抗蟲研究的熱點。茶樹組成型揮發物（即健康茶樹揮發物）和蟲害誘導型揮發物（即蟲害茶樹揮發物）是茶樹抗蟲性的重要方面。

茶小綠葉蟬Empoasca sp.是我國重要的茶樹害蟲，其為害嚴重影響到茶葉的質量和產量，利用茶樹品種抗蟲性來減輕茶園蟲害的發生，是一條有意義的途徑。蔡曉明[4]研究了茶樹受小綠葉蟬取食誘導后揮發物的釋放動態，認為茶樹主要誘導型揮發物于小綠葉蟬取食后1 h開始釋放，4 h時大量產生，取食6 h后開始大量降低，不同種類害蟲危害茶樹所釋放的揮發物均呈現晝高夜低的特點。目前，在寄主揮發性成分研究方面，最常用的研究方法為氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer， GC-MS）、電子鼻等技術[5-6]。GC-MS是比較精確的混合物解析手段，在對混合型揮發物的分析中，首先根據各化合物組分沸點的不同，采用氣相色譜將混合物各成分進行分離，分離后的各組分物質先后通過質譜，經過一定的電離方式，將分子轉化為離子碎片，根據不同物質有不同的離子形態，對各成分物質進行解析。利用GC-MS解析可揮發的化合物，具有客觀性、重復性好等特點[7]。

王蔚等[8]之前對福建省主要烏龍茶茶樹品種上茶小綠葉蟬的蟲口密度進行了長期調查，結果顯示，肉桂上的茶小綠葉蟬的蟲口密度最大，鐵觀音上的蟲口密度最小;其次，不同品種的健康茶樹總體揮發物特征不同，隨著蟲害的發生、蟲口數量的增加和危害時間的延長，各品種的誘導揮發物也發生變化，這可能是茶小綠葉蟬在不同品種上蟲口分布差異顯著的重要原因。另外，蔡曉明[4]的研究結果表明，茶樹被蟲害誘導釋放揮發物的量隨著時間有一定規律。基于以上理論，本研究運用GC-MS技術，具體分析了肉桂和鐵觀音2個抗蟲水平不同的茶樹品種在茶小綠葉蟬不同危害時間點，揮發物成分組成和含量上的差異，為茶樹品種抗蟲機理提供理論支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料樣品為福建省主要烏龍茶茶樹品種鐵觀音和肉桂。每個處理剪取鐵觀音和肉桂10 cm長的新梢5枝，分別裝入8個揮發物收集裝置中的樣品收集瓶。樣品的處理為：鐵觀音對照茶梢（TGY-CK）、鐵觀音蟲害茶梢（TGY-CH）、肉桂對照茶梢（RG-CK）和肉桂蟲害茶梢，每個處理做3個重復。其中，TGY-CK和RG-CK為不接蟲的健康茶樹新梢，TGY-CH和RG-CH為茶梢接蟲處理。6個接蟲處理接入的供試昆蟲分別為60頭3齡茶小綠葉蟬，統一來源于應用生態研究所葉蟬飼養室。供試昆蟲接入前進行2 h饑餓處理。揮發物的采集時間為4、8 h，即持續采集以上處理4 h的揮發物和以上處理8 h的揮發物，進行揮發的定性定量分析。揮發物收集裝置見圖1。

1.2? 方法

1.2.1? 茶樹揮發物的收集? 茶樹揮發物的收集參照張篷軍等[9]的方法，稍作改動，如圖1所示，空氣經由空氣壓縮機流入放有活性炭的干燥裝置進行過濾，經由空氣流量計A計算空氣流量，在此次實驗中空氣流量控制在200 mL/min左右，最終流入20 L的樣品收集瓶內。茶梢根部放入盛有水的錐形瓶里，正立放入收集瓶內，經不同時間、不同蟲害條件處理后收集的氣體揮發物，通過吸附管內的吸附劑吸附。最后經過空氣流量計B，隨時監控在此循環中的空氣流動情況，確保吸附管內的空氣流動量。揮發物收集完成后，卸下吸附管，用500 L的色譜純二氯甲烷淋洗吸附劑，隨后在樣品中加入0.05 μg的乙酸壬酯（nonyl acetate）做為內標用于GC-MS的相對定量，具體參照Liu等[10]方法。需要強調的是，茶樹揮發物及其蟲害誘導揮發物的收集采用動態頂空吸附法，即氣流進入揮發物收集缸之前先經過活性炭、分子篩及變色硅膠進行洗氣，以凈化空氣及除去水分，然后，再揮發物收集缸的出氣口處安裝填充有Porapak Q吸附劑（70 mg）的吸附柱，各部分間用Teflon管進行連接。進氣端和出氣端的空氣流速皆由玻璃轉子流量計調節。

1.2.2? 茶樹揮發物GC-MS的測定及定性定量分析? 氣相色譜質譜聯用儀型號為7980B-5977A GC/MS（安捷倫，美國）。柱溫起始溫度設定為40 ℃，以5 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。載氣為氦氣，載氣流速1 mL/min。質譜采用EI電離方式，轟擊電壓70 eV，全掃描，掃描范圍為35～550，檢索譜庫為NIST11。

定性方法：①樣品中的各個成分與相應的標準化合物在GC-MS上保留時間的吻合度;②樣品組分的質譜特征離子峰與GC-MS譜庫中標準化譜峰的對比;③相關茶葉香氣及揮發物文獻。定量方法：算出總離子流色譜圖中樣品各成分的離子流峰面積與內標峰面積的比值而相對定量，內標物為癸酸乙酯。

1.3? 數據分析

實驗數據采用SAS 6.12軟件進行分析，用Duncans multiple-range test方法進行方差分析。

2? 結果與分析

通過對肉桂和鐵觀音健康茶樹和蟲害誘導茶樹揮發物的收集，經GC-MS的分析鑒定，共解析得到21種化學成分，包括醇類、烯類、烷烴、醛類、酯類和酮類。其總離子色譜圖見圖2和圖3，揮發物成分的組成及其相對含量見表1。

2.1? 茶樹組成型揮發物的分析

從2個品種的健康茶樹上共鑒定出16種揮發物成分，如表1所示。其中，鐵觀音有12種，主要成分包括鄰異丙基苯甲烷、β-羅勒烯、反式-β-羅勒烯、α-法呢烯、γ-萜品烯和3-甲基-3-環己烯- 1-酮;肉桂鑒定出15種揮發性物質，主要成分有鄰異丙基苯甲烷、β-羅勒烯、α-法呢烯和3-甲基- 3-環己烯-1-酮。2個品種的健康茶樹揮發物組成和各組分在含量上都存在差異。芳樟醇只在鐵觀音的健康茶梢中被檢測到，肉桂未檢測到該物質。相反，少量的十三（碳）烷、乙酸辛酯、十六烷和雪松醇只在肉桂上檢測到，鐵觀音上未檢測到。做為共有的組成型揮發物，β-月桂烯、β-羅勒烯、反式-β-羅勒烯和α-法呢烯在鐵觀音上的含量遠遠大于肉桂，鐵觀音中β-月桂烯在4 h-CK時是肉桂的3倍、8 h-CK時是肉桂的5倍;鐵觀音揮發的β-羅勒烯在4 h-CK時和8 h-CK時分別是肉桂的3.88、9.90倍;另外，鐵觀音揮發的α-法呢烯在4 h-CK時高達8.45，而肉桂4 h-CK揮發物未檢測到該物質，8 h-CK的鐵觀音揮發物中含α-

法呢烯是肉桂的14.36倍。結合二者電子鼻分析和田間蟲口密度調查的結果[8]，推斷鐵觀音和肉桂揮發物這種組成成分上的差異，導致了二者健康茶梢揮發物的總體特征截然不同，這是茶小綠葉蟬在二者上選擇趨性差異明顯的重要原因。

RG-CK-4h：肉桂，健康茶梢，收集揮發物4 h;RG-CK-4h：肉桂，健康茶梢，收集揮發物8 h;RG-CH-4h：肉桂，蟲害茶梢，收集揮發物4 h;RG-CH-8h：肉桂，蟲害茶梢，收集揮發物8 h。

2.2? 茶樹蟲害誘導揮發物的分析

茶樹受小綠葉蟬危害一段時間后，共產生18種揮發物質，如表1所示。其中，鐵觀音檢測到18種，肉桂檢測到17種。較之危害前，二者在揮發物含量上也產生了較大的變化。受茶小綠葉蟬危害后，鐵觀音和肉桂都釋放大量的β-月桂烯、β-羅勒烯、反式-β-羅勒烯、α-法呢烯和芳樟醇，?在危害4 h和8 h的揮發物測定中，2個品種的這些成分較危害前的增加量從1.49倍到41.22倍不等。此外，茶小綠葉蟬的危害還誘導了新的揮發物的產生，包括（Z）-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯和苯乙醇。相反，在2個品種健康茶梢的揮發物中均存在的檸檬烯、石竹烯和3-甲基-3-環己烯-1-酮，隨著葉蟬的取食危害，這3種物質不再產生。另外，值得一提的是，β-月桂烯、β-羅勒烯、反式-β-羅勒烯、-法呢烯和芳樟醇在2個品種上的含量差異較大，這5種物質即是2個品種的組成型揮發物成分，也是誘導揮發物。

鐵觀音的健康茶梢上這5種物質含量均高于肉桂，但是，肉桂受葉蟬危害后，這5個物質釋放的含量大部分高于鐵觀音受葉蟬危害所釋放的量（蟲害處理8 h時β-羅勒烯和α-法呢烯除外）。由此可推斷，（Z）-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯、苯乙醇、β-月桂烯、β-羅勒烯、反式-β-羅勒烯、α-法呢烯和芳樟醇這10種揮發性物質可能跟茶樹的誘導抗性和鐵觀音的抗蟲性有關。特別是β-羅勒烯和α-法呢烯在茶樹抗蟲機制中所起的作用有待于進一步研究。

3? 討論

蔡曉明[4]研究發現，茶樹主要誘導型揮發物于小綠葉蟬取食后1 h開始釋放，4 h時大量產生，取食6 h后開始大量降低，不同種類害蟲危害茶樹所釋放的揮發物均呈現晝高夜低的特點。因此，本研究的揮發物收集實驗選擇于白天清晨9點開始，持續收集4 h和8 h健康茶梢揮發物和蟲害誘導揮發物進行分析。此外，本研究中肉桂蟲害茶梢的揮發物共檢測到17種物質，通過比較發現，該品種蟲害4 h揮發物有12個組分大于蟲害8 h的釋放量，其中有5個組分達顯著性差異、5個組分只在4 h蟲害茶梢中檢測到，蟲害誘導4 h揮發物的釋放量遠遠高于8 h。這與蔡曉明[4]發現的茶樹揮發物的釋放規律一致。相比之下，蟲害誘導鐵觀音揮發物的釋放卻沒有明顯的規律性。雖然大量物質-羅勒烯和-法呢烯在8 h蟲害茶梢上的釋放量遠遠高于4 h，但其他大部分揮發物組分的釋放量在二者之間差異不顯著。這可能與2個茶樹品種的抗蟲強弱有關。鐵觀音對小綠葉蟬抗性較強，而肉桂對小綠葉蟬抗性最弱，是感蟲品種。在實驗處理中，葉蟬接到2個品種上，通過寄主識別后，肉桂上葉蟬可能會更早開始刺探和取食，并且對寄主的危害強度較大，因此能更快的誘導肉桂釋放蟲害誘導揮發物。而葉蟬接到鐵觀音上后，由于寄主的適合度較低，葉蟬并不會馬上取食和危害，其辨識和接受過程較長，導致部分蟲害誘導揮發物的釋放高峰期后移。

Mei等[11]在東方美人茶特殊香氣形成機制的研究中表明，小綠葉蟬危害使茶樹葉片形成和釋放更多的芳樟醇，這一特殊過程賦予東方美人茶獨特的來自芳樟醇的單萜揮發物。本研究中，少量芳樟醇只在鐵觀音的健康茶梢中被檢測到，而該物質在蟲害4 h的鐵觀音和肉桂上大量產生，蟲害8 h后又逐漸減少，但仍然高出蟲害前鐵觀音的7倍多。本研究結果證實了Mei等的論點。

由于不同品種釋放的揮發物的種類、濃度和比例存在差異，有些茶樹品種可以吸引害蟲取食，而有些品種則可以避免或減輕危害[12-13]。本文在實驗中發現鐵觀音與肉桂有著明顯的抗蟲性差異，且鐵觀音的抗蟲性要高于肉桂。在對其組成型揮發物和蟲害誘導性揮發物進行對比中發現，抗蟲品種鐵觀音蟲害處理4 h和8 h都釋放了遠遠多于健康對照的β-羅勒烯和α-法呢烯，肉桂卻呈現相反的現象。王夢馨等[14]、韓善捷等[15]、穆丹[16]、王國昌[17]、蔡曉明[4]的研究結果均證實，茶樹在小綠葉蟬危害后誘導釋放更多的β-羅勒烯和α-法呢烯，與本文結果完全一致。劉亞麗[18]對蚜蟲和粉虱為害黃瓜揮發物的測定結果也顯示，被害蟲危害后寄主釋放出更多的羅勒烯。因此，可以推斷羅勒烯和α-法呢烯在葉蟬選擇寄主過程中有重要作用，α-法呢烯可能能夠引誘葉蟬的選擇危害。而所測得的揮發性物質具體對茶小綠葉蟬有引誘或是趨避的作用，或是具有吸引天敵的作用，這都需要進一步使用純的樣品揮發物，對茶小綠葉蟬或是植食性天敵進行嗅覺定向行為研究。因此要找到揮發物在影響茶小綠葉蟬選擇不同茶樹品種中的準確機理，必須得到已檢測出的有可能對茶小綠葉蟬有影響的揮發物對其或是植食性天敵的嗅覺定向行為等具體研究信息。

雖然本研究還需利用生測手段進一步明確β-羅勒烯、α-法呢烯等在茶樹抗蟲方面的生物功能，但β-羅勒烯和α-法呢烯的相關研究已有大量報道。有研究結果表明，茶樹被茉莉酸誘導可以產生新的揮發物β-羅勒烯和α-法呢烯，而且這2種成分參與鄰近茶樹之間的信號通訊[19]。也有研究認為，β-羅勒烯和α-法呢烯在植物抗逆中有重要的生態功能，β-羅勒烯是一種與植物防御啟動密切相關的信號分子，它不僅能直接提高植物對某些病原菌及食草類昆蟲的抗性，如上調一些植株中茉莉酸（jasmonic acid， JA）和乙烯（ethylene， ET）信號途徑的表達水平;同樣也能充當植物之間的信號傳遞分子，幫助受害植株周圍的植株免遭傷害[20-21]。而α-法呢烯則是由茉莉酸甲酯激發植物大量釋放的，并非從植物的所貯存的萜烯庫中來[20， 22]。

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