內源H2O2對水稻種子萌發的影響

肖羽 馮紅玉 陳惠萍

摘? 要? 通過用不同濃度的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）合成酶抑制劑碘二苯（diphenylene iodonium， DPI）及過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）清除劑二甲基硫脲（dimethylthiourea， DMTU）分別培養水稻（Oryza sativa L.）種子，研究內源H2O2對種子萌發過程胚根、胚芽和胚根根尖活力等的影響。結果表明，DPI及DMTU培養的水稻種子其胚根生長和胚芽生長均受到抑制，尤其是DPI對胚根生長的抑制作用更為顯著。DPI和DMTU對水稻種子萌發的影響均呈現出濃度效應，即濃度越高，抑制作用越強。其中，DPI對水稻種子萌發的抑制作用比DMTU的更為明顯。此外，胚根根尖的超氧陰離子（superoxide anion， O2）和H2O2含量隨DMTU濃度增大而減少，根尖細胞受損也越嚴重。由此推測，內源H2O2可能參與調控水稻種子萌發過程。

關鍵詞? 內源H2O2;種子萌發;DPI;DMTU

中圖分類號? S511? ? ?文獻標識碼? A

種子萌發是指具有生活力的種子吸水膨脹后，胚根突破種皮的過程[1]。種子能否正常萌發對其后期是否能夠正常生長發育，以及正常結實具有重要的作用。種子萌發受到外部和內部因素雙重影響，外部因素主要包括光照、溫度、水分等;內部主要受到自身基因、激素及活性氧等影響。

過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）是植物正常生理過程產生的代謝產物，早先被認為僅是具有毒害作用的活性氧[2]。但近年的研究發現，適當濃度的H2O2可作為逆境信號分子，參與調控植物的抗逆性[3-4]。已有研究證實，外源H2O2可以提高鋁脅迫下小麥根尖的抗氧化代謝水平，緩解鋁脅迫導致的氧化損傷，從而增強小麥對鋁脅迫的適應性[5]。適量的外源H2O2還可降低干旱下水稻糊粉層細胞內H2O2的含量，延緩糊粉層細胞程序性死亡（programmed cell death， PCD）[6]，從而緩解干旱對水稻種子萌發的影響。

植物體內H2O2主要是由NADPH合成酶途徑產生。碘二苯（diphenylene iodonium， DPI）作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）合成酶專一性抑制劑，預處理棉花種子會降低種子萌發率[7]。二甲基硫脲（dimethylthiourea， DMTU）是H2O2的清除劑，可降低H2O2含量，從而抑制萵苣種子萌發[8];DPI和DMTU均可減少干旱條件下水稻糊粉層中過量的H2O2，以提高淀粉酶活性，緩解干旱對水稻種子萌發的抑制作用[9]。DPI和DMTU還可降低中國石竹超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）活性[10]，影響山黎豆種子萌發和初生根生長[11]。

目前對于內源H2O2影響正常生長條件下水稻種子萌發的研究仍較少，因此，本研究用不同濃度NADPH合成酶抑制劑DPI和H2O2清除劑DMTU處理水稻種子，闡明其胚根和胚芽生長等萌發狀況，并探究DMTU處理下胚根根尖超氧陰離子（superoxide anion， O2）含量和H2O2含量及細胞膜透性的變化，以期為進一步研究內源H2O2調控水稻種子萌發的機理奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實驗材料為水稻（Oryza sativa L.）雜交種‘博Ⅱ優767種子，購自海南儋州種子站。選取均勻飽滿、大小一致、去除稻殼的種子50粒，放入墊有雙層濾紙的培養皿中，并于光照培養箱進行培養。培養條件為：光照周期16/8 h（晝/夜），光照強度400 μmol/（m2·s），溫度26 ℃。

1.2? 方法

1.2.1? 實驗處理? 實驗設為13個處理：分別包括水（CK）、DPI和DMTU。其中，DPI設置6個濃度，分別為10、20、30、40、50、60 μmol/L，同樣DMTU 也設置有6個濃度，包括10、20、30、40、50、60 mmol/L，每個處理設3次重復，每天更換對應的處理液。

1.2.2? 胚芽長、胚根長觀測及測量? 分別于培養的24 h及48 h觀測并拍照萌發水稻種子。培養3 d后，從每個處理中隨機選取10粒種子，純水洗凈并用濾紙吸干表面水分，用直尺測量胚根長和胚芽長。

1.2.3? 根系活性氧含量高低及質膜透性大小觀察 參照氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazorium blue chloride， NBT）染色法[12]觀察水稻種子胚根根尖O2含量。分別從各處理中隨機選取培養3 d的萌發水稻種子，用手術刀切取根尖放入NBT染液（1 mmol/L，pH 5.8）中染色5 min，用純水多次沖洗根尖，洗凈后觀察。

參照二氨基聯苯胺（diaminobenzidine， DAB）染色法[13]觀察水稻種子胚根根尖H2O2含量。同樣隨機選取培養3 d的萌發水稻種子，切取根尖于二氨基聯苯胺染液（1 mg/mL，pH 5.8）中染色30 min后，用純水洗凈、觀察。

參照伊文思藍染色法[14]觀察質膜透性大小。將萌發3 d水稻種子根尖放入0.125%伊文思藍染液染色5 min后，取出用蒸餾水洗凈觀察。

以上水稻種子胚根根尖染色后，均采用Olympus（SZX7）體式顯微鏡觀察并拍照。

1.3? 數據處理

實驗數據采用SPSS軟件進行方差分析（analysis of variance， ANOVA），對處理間的差異性多重比較采用最小顯著性差異法（least significant difference， LSD）進行分析，用Excel和Photoshop軟件作圖。

2? 結果與分析

2.1? NADPH合成酶抑制劑DPI對水稻種子萌發中胚根生長和胚芽生長的影響

由圖1可見，在水培養24 h后，水稻種子的胚根和胚芽均突破了種皮，而不同濃度DPI培養24 h后，只有10 μmol/L處理的種子稍微露出胚根和胚芽，20、30 μmol/L處理的僅露出胚芽部分，其余處理的胚根和胚芽均未露出。浸種48 h后，水培養的胚根遠長于胚芽，10～30 μmol/L DPI處理的水稻種子僅露出一小段胚根，而40～60 μmol/L DPI處理的水稻種子則未見胚根露出。雖然不同濃度DPI處理下均可觀察到胚芽，但隨著DPI濃度的升高，胚芽長度逐漸縮短。以上結果表明，NADPH合成酶抑制劑DPI以依賴濃度效應影響水稻種子胚根及胚芽生長，且對胚根生長的影響效應遠大于對胚芽的影響。

由于DPI對胚根生長抑制較嚴重，致使培養3 d的水稻種子大部分未有胚根露出，因此，本研究僅對DPI處理的水稻種子胚芽長度進行測量。從圖2可知，與水培養的胚芽長度相比，不同濃度NADPH合成酶抑制劑DPI培養水稻種子3 d后，胚芽的長度受到明顯的抑制，抑制率均超過50%，且隨著處理濃度的遞增，胚芽長度顯著地遞減。

由此可見，因DPI減少了水稻種子內由NADPH途徑產生的內源H2O2，從而影響了水稻種子萌發過程胚根及胚芽的生長，尤其是嚴重抑制胚根的生長。這些結果表明了由NADPH途徑產生的內源H2O2在調控水稻種子萌發中起著關鍵的作用。

2.2? H2O2清除劑DMTU對水稻種子萌發中胚根和胚芽生長的影響

如圖3所示，不同濃度DMTU培養水稻種子24 h后，其胚根全部突破種皮，其中10 mmol/L DMTU處理的胚根長度與正常處理的較為接近，20 mmol/L DMTU處理的胚根長度與30 mmol/L DMTU處理的也極為接近，且均明顯高于40～ 60 mmol/L DMTU處理的。同時，不同濃度DMTU處理的胚芽長度均明顯不如正常處理的，其中，60 mmol/L DMTU處理的胚芽仍未伸長，10～ 30 mmol/L DMTU處理的胚芽長度較為接近，40 mmol/L及50 mmol/L DMTU處理的胚芽僅露出一點。水稻種子經過48 h培養后，10 mmol/L DMTU處理的胚芽及胚根長與正常處理的較為接近，20 mmol/L與30 mmol/L DMTU 處理的胚芽及胚根長度也較為接近，而50、60 mmol/L DMTU處理的胚根長度明顯不如其他濃度DMTU處理的。由此可見，水稻種子經過不同濃度H2O2清除劑DMTU處理24 h或48 h后，萌發情況與DPI處理的相似，均呈現濃度效應，亦隨著DMTU濃度增大，對胚根及胚芽生長的抑制作用越大。

H2O2清除劑DMTU培養水稻種子3 d后，水稻種子胚根長隨著DMTU濃度依次遞增而逐漸降低，且降低的幅度較為平緩（圖4）。10 mmol/L DMTU處理的胚根長約為水處理胚根長的70%，從30 mmol/L開始，相鄰濃度間胚根長依次減少0.3 cm左右（p<0.05，圖4）。其中10 mmol/L DMTU處理的胚根長分別為40 mmol/L處理的2倍、50 mmol/L處理的3倍和60 mmol/L處理的5倍左右。

由圖5可見，10 mmol/L DMTU處理對胚芽生長影響較小，在處理水稻種子3 d后，其胚芽長度仍為正常處理的88%。20、30 mmol/L DMTU處理對胚芽長度的影響較為接近，僅相差0.1 cm，約為正常處理的70%～65%，這兩者間差異不顯著。與正常處理相比，40 mmol/L DMTU處理的胚芽長度被抑制了50%，50～60 mmol/L DMTU處理對胚芽長度的抑制極其顯著，其中60 mmol/L DMTU處理的胚芽長度僅為正常處理的30%（p<0.05）。

由此可見，清除種子內H2O2抑制了水稻種子萌發過程胚根和胚芽的生長，從而影響種子的萌發，表明水稻種子的萌發需要種子內一定量的H2O2參與。

2.3? H2O2清除劑DMTU對萌發水稻種子胚根根尖O2產生的影響

O2可與NBT反應生成藍紫色不溶于水的顯色物，其顏色深淺代表O2的含量高低，顏色越深，O2積累越多。由圖6可以看出，正常處理的胚根根尖顏色最深，即其O2含量最高;10 mmol/L DMTU處理的胚根根尖顏色僅次于正常處理的，20～ 40 mmol/L DMTU處理的胚根根尖顏色隨著濃度升高而變淺，表明O2含量隨濃度升高而減少;50、60 mmol/L DMTU處理的胚根根尖僅被輕微染色。因此，隨著H2O2清除劑DMTU濃度的升高，萌發水稻種子胚根根尖顏色逐漸變淺，即根尖O2含量隨之減少，呈現出一定的濃度效應。

2.4? H2O2清除劑DMTU對萌發水稻種子胚根根尖H2O2產生的影響

植物體內H2O2被過氧化物酶分解后，可與DAB生成不溶于水的棕色產物，因此，根據顏色的深淺可以反映出細胞內H2O2含量的高低，顏色越深，H2O2的含量就越高。如圖7所示，正常處理的萌發水稻種子胚根根尖染色最深，10 mmol/L DMTU處理的胚根根尖顏色比正常處理的的稍淺，說明10 mmol/L DMTU處理的胚根根尖H2O2含量與正常處理的較為接近，20、30 mmol/ L DMTU兩者處理的根尖顏色也比較接近，50 mmol/L DMTU處理的根尖只有輕微染色，

60 mmol/L DMTU處理的胚根根尖幾乎沒染上顏色。因此，隨著DMTU處理濃度越高，水稻種子胚根根尖染色越淺，且著色多集中于根尖前端，表明水稻種子胚根中H2O2含量與O2含量趨勢相同，H2O2清除劑DMTU濃度越大，H2O2含量與O2含量越少。

2.5? H2O2清除劑DMTU對萌發水稻種子胚根根尖細胞透性的影響

伊文思藍可進入細胞膜透性增大的細胞，藍色深淺代表根尖細胞膜透性大小，顏色越深，細胞膜透性越大，表明細胞受傷害程度越高。從圖8可見，隨著DMTU濃度逐漸增大，萌發水稻種子胚根根尖伊文思藍染色逐漸加深。正常處理的胚根根尖染色最淺，表明其細胞膜透性最小，細胞受傷害最輕;10～30 mmol/L DMTU處理的胚根根尖染色慢慢變深，即細胞膜透性逐漸增大;從40 mmol/L DMTU處理開始染色急劇加深，至60 mmol/L DMTU染色最深，說明此時細胞受傷害最嚴重。由此可見，隨著DMTU濃度增加，伊文思藍染色越來越深，表明胚根根尖細胞膜透性變大，即細胞受傷害程度逐漸增大，而根系活力逐漸變小，胚根正常生長受到一定的影響。

3? 討論

NADPH氧化酶存在于細胞質膜上，通過將NADPH中的電子轉移給O2生成O2，然后由SOD將O2歧化成H2O2[3-4]。

在本研究中，不同濃度的NADPH氧化酶抑制劑DPI處理水稻種子后，其胚根長和胚芽長都受到明顯抑制，并呈現出濃度效應，即濃度越高，抑制效果越明顯。其中，20 μmol/L DPI處理的胚芽長度約為對照的45%左右，30～60 μmol/L DPI處理的胚根幾乎不生長。孔祥強等[7]研究表明，用DPI預處理棉花種子后，種子內H2O2含量降低，萌發率也降低。此外，DPI處理綠豆幼苗外植體48 h后，不定根形成會完全被抑制，說明細胞中H2O2產生變少，導致綠豆不定根生長受阻[15]。本

研究結果顯示，DPI作為NADPH合成酶專一性抑制劑可抑制由NADPH途徑產生的內源H2O2，進而阻礙水稻種子萌發及生長，尤其是胚根的生長。因此，我們推斷，由此產生的內源H2O2與水稻胚根生長發育緊密相關，并且可能是調控水稻胚根生長與發育的重要因子。

在本研究中，水稻種子經DMTU處理后，也呈現出濃度效應，即胚根及胚芽生長受到的抑制作用均隨DMTU濃度遞增而增強，且DMTU對胚根和胚芽的抑制作用相當。張鳳芝等[8]的研究也證實，萵苣種子經DMTU處理后，因H2O2被清除，導致外源多鞍對種子萌發的促進作用降低，從而使種子萌發受到抑制。此外，對水稻種子胚根根尖染色觀察分析結果也表明，隨著DMTU濃度增大，H2O2含量及O2含量逐漸減少，而細胞膜透性卻逐漸增大，即胚根根尖細胞受傷害程度加深。林瑩等[16]研究與本研究結果相似，用NBT對大豆種子胚軸進行染色，正常種子萌發過程會產生O2，胚軸可被NBT完全染色，而老化的種子由于失去活力，萌發生長受到影響，導致O2產生較少，因此部分區域無染色。

在正常條件下，植物體內活性氧產生與清除處于動態平衡，因此，植物能維持正常生命活動，但一旦這種平衡被打破，其生命活動即受到影響。在本研究中，DPI和DMTU均顯著影響水稻種子胚根和胚芽的生長，并且DPI比DMTU對水稻種子萌發的抑制效果更顯著。張倩倩等[10]研究表明，DPI和DMTU有效地清除和減少正常條件下生長的石竹幼苗葉和根中O2和H2O2，并且這種效果在根中更為明顯，這與本實驗結論相一致。通過對本實驗結果進行分析，我們推測可能水稻種子正常萌發所需的內源H2O2主要來自NADPH氧化酶途徑產生的H2O2，而H2O2清除劑DMTU對水稻種子萌發的抑制效果不如DPI，可能是DMTU清除的H2O2中只有部分是來自由NADPH氧化酶途徑產生的H2O2。本研究還證實DPI對水稻種子胚根的影響遠大于對胚芽的影響，說明NADPH產生的內源H2O2主要是通過調控水稻種子胚根的發生來影響萌發。此外，DMTU因清除部分NADPH氧化酶途徑產生的H2O2，因此，在一定程度阻礙了胚根及胚芽的生長，且胚根根尖O2含量和H2O2含量都有所減少，并引起根尖細胞損傷，從而使水稻種子的正常萌發受到影響。總之，維持內源H2O2產生與清除動態平衡對水稻種子萌發及生長至關重要。

參考文獻

王? 瓊. 水稻種子萌發過程中RAmy1A基因的特異轉錄因子的篩選與鑒定[D]. 北京：中國科學院大學， 2016.

Larkindale J， Huang B. Thermotolerance and antioxidant systems in Agrostis stolonifera： involvement of salicylic acid， abscisic acid， calcium， hydrogen peroxide， and ethylene[J]. Journal of Plant Physiology， 2004， 161（4）： 405-413.

Neill S J， Desikan R， Clarke A， et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants[J]. Journal of Experimental Botany， 2002， 53（372）： 1237-1247.

Hung S H. Hydrogen peroxide functions as a stress signal in plants[J]. Botanical Bulletin of Academia Sinica， 2005， 46（1）： 1-10.

徐芳杰. 過氧化氫作為信號分子在小麥耐鋁性中的作用及機理[D]. 杭州：浙江大學， 2011.

Wang G， Xiao Y， Deng X， et al. Exogenous hydrogen peroxide contributes to heme oxygenase-1 delaying programmed cell death in isolated aleurone layers of rice subjected to drought stress in a cGMP-dependent manner[J]. Frontiers in Plant Science， 2018， 9： 84.

孔祥強， 羅? 振， 張艷軍， 等. 過氧化氫預處理促進鹽脅迫下棉花種子萌發的效應[C]//全國棉花青年學術研討會， 2015.

張鳳芝， 胡文婷， 蘇國興. 多胺降解產生H2O2在萵苣種子萌發過程中的作用[J]. 蘇州大學學報（自然科學版）， 2011， 27（1）： 84-89.

王光輝. HO-1協同H2O2調控干旱誘導的水稻糊粉層PCD的發生[D]. 海口： 海南大學， 2014.

張倩倩， 蔚? 瀟， 賀學勤. 過氧化氫清除劑對H2O2處理下中國石竹幼苗不同器官抗氧化系統的影響[J]. 北方園藝， 2016（22）： 82-86.

蔣景龍. 外源過氧化氫抑制山黧豆種子萌發期初生根的向地性生長并誘導其發生水平彎曲[D]. 蘭州： 蘭州大學， 2012.

Lee S E， Shin H T， Hwang H J， et al. Antioxidant activity of extracts from Alpinia katsumadai seed[J]. Phytotherapy Research， 2003， 17（9）： 1041-1047.

Biondi S. Ectopic expression of maize polyamine oxidase and pea copper amine oxidase in the cell wall of tobacco plants[J]. Plant Physiology， 2004， 134（4）： 1414.

韓明明. 鎘鋅互作下H2O2對水稻根系生長發育的影響[D]. 淄博： 山東理工大學， 2011.

李師翁. H2O2在綠豆不定根形成與發育中的信號作用及其機理[D]. 蘭州： 蘭州大學， 2007.

林? 瑩. 老化大豆胚軸細胞死亡生物學基礎的研究[D]. 福州： 福建農林大學， 2012.