“二加二”法建立金線蓮類原球莖培養新體系

焦展 安勝軍 邵鐵梅

摘? 要? 本研究以金線蓮組培苗莖段為試材，采用“二加二”法，即“兩步誘導”（1. 利用暗培養誘導出白化莖段;2. 由白化莖段誘導類原球莖）加“兩步增殖”（1. 新誘導的類原球莖在誘導培養基上培養3周;2. 利用L16（45）正交試驗優選增殖培養方案）的方法，研究外植體來源、外植體處理方式、暗培養時間、培養基及附加成分對類原球莖誘導的影響，以及培養時間、光照強度、紫外光照射時間對類原球莖增殖的影響，并比較“二加二”法與傳統單步法的培養效果。結果表明，適宜白化莖段誘導類原球莖的培養基為MS + 2.5 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L S3307。黑暗腋生白化莖段是最佳外植體，最佳處理方式為整個莖段平放，3周暗培養得到的白化莖段能夠顯著提高類原球莖的誘導率。增殖培養5個因素對結果的影響順序為：NH4+/NO3?>NAA濃度>6-BA濃度>S3307濃度>蔗糖濃度。最佳配比為MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+ NH4+/NO3?（15 mmol∶45 mmol）+ 蔗糖40 g/L，可獲得增殖鮮重為246.90 g/L。增殖培養最佳時間6周。光照強度500 lx和253.7 nm紫外光每天照射6 h連續6周適宜類原球莖的增殖和總黃酮的積累。利用“二加二”法建立了金線蓮類原球莖高效培養新體系，該體系誘導率、初始材料擴大倍數、增殖倍數均高于傳統單步誘導法。92%的類原球莖能夠穩定增殖，不發生分化和愈傷組織化。

關鍵詞? 金線蓮;類原球莖;高效體系;誘導;總黃酮

中圖分類號? Q 949.9;S567.239? ? ? 文獻標識碼? A

金線蓮（金線蘭），學名花葉開唇蘭[Anoecto chilus roxburghii （Wall.） Lindl.]，是蘭科開唇蘭屬珍稀藥用植物。近年來，其保肝護肝、抗氧化、抗衰老、提高機體免疫力等藥用價值，已引起人們的廣泛關注[1-3]。自然環境的惡化和人們的過度采挖，使得野生金線蓮資源嚴重匱乏，藥材資源供不應求。原球莖是蘭科等科屬的植物繁殖過程中的一種特殊的胚狀結構，組織培養可培育類似原球莖的結構，稱為“類原球莖”（protocorm-like bodies，PLBs）。類原球莖培養具有繁殖效率較高，培養周期短的優點。利用組織培養的方法培養類原球莖并從中提取藥用植物有效成分是擴大藥材資源，拓展藥材利用的有效手段。

金線蓮類原球莖組織培養已有部分研究[4-6]，研究內容局限于類原球莖的誘導與增殖的培養基配方[7]，以及不同添加物和不同培養條件對類原球莖誘導的影響[8-9]，近年來拓展到用類原球莖生產次生代謝產物的研究[10]。以往研究都是通過單步直接誘導，大致分為兩種途徑：一種是從種子直接獲得原球莖[6-7]再進行增殖，但金線蓮資源不足，種子量有限，大量應用難以滿足生產需求;第二種是從組培苗莖段或莖節直接誘導類原球莖[5， 8]。此途徑應用較廣，但仍存在許多問題：如初代誘導困難，誘導率低[8， 11-12]。王建勤等[12]利用莖節做接種材料誘導率僅為66%。封應麗等[8]的研究中誘導率提升至73%。韓曉紅等[13]以莖段切片為外植體，初步提高材料利用率，誘導率為81%，但仍不夠理想。此外，類原球莖增殖培養中常遇到“類原球莖穩定性較差，易分化，易愈傷組織化”的問題[11， 13-14]，嚴重降低其增殖效率，限制類原球莖培養體系在生產次生代謝產物領域的應用。因此，本研究擬探索一種新的方法，即“兩步誘導”加“兩步增殖”的方法，簡稱“二加二”法，先誘導白化莖段再誘導類原球莖并使其高效增殖，以期提高誘導率，同時數倍提高初始材料利用率，并進一步構建能夠穩定增殖的類原球莖培養系統，為金線蓮類原球莖生產藥用成分的研究奠定基礎，也作為蘭科植物的原球莖培養等相關研究的參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 金線蓮品種為“福建尖葉”，帶根組培植株采購于福建金草公司，切取莖段后在本實驗室經過連續1 a的繼代培養，獲得長勢基本一致的金線蓮組培繼代植株。

1.1.2? 試劑? ?植物生長調節劑6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA）、玉米素（Zeatin，ZT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4- Dichlorophenoxyacet ic acid，2，4-D）、激動素（Kinetin，KT）、噻苯隆（Thiazuron，TDZ）、烯效唑（Uniconazole， S3307），購自上海生工生物工程有限公司。對照品為蘆丁（BBI），化學試劑亞硝酸鈉（科密歐），硝酸鋁（科密歐）。

1.1.3? 儀器? 蘇凈安泰SW-CJ-2FD型超凈臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;SJC-Ⅱ型紫外線殺菌車，北京好特光紫外線科技有限公司;SPX-250I-G型微電腦人工氣候箱，上海博訊實業有限公司;ZHWY-1102C型恒溫培養振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司;UV-5200型紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? “兩步誘導”法誘導類原球莖? 第一步：外植體的獲得。切取金線蓮組培繼代植株的莖段（外植體來源實驗除外），每莖段帶1至2個節，放置于B1培養基（MS + 6-BA 2.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L）中，溫度27 ℃，黑暗培養3周后（黑暗培養時間試驗除外），收獲白化莖段。

第二步：類原球莖的誘導。切取長度為1 cm的白化莖段（每莖段帶一個節），放置于培養基Y1～Y9（待篩選）中，每瓶放置外植體14個，每處理6瓶，重復3次。光照500 lx，光照時間12 h，培養4周，收獲類原球莖。Y培養基的篩選：比較9種不同的誘導培養基（表1），4周后比較類原球莖的誘導率和誘導個數。誘導率=每處理誘導出類原球莖的外植體數/接種外植體數×100%;平均誘導PLB個數=每處理誘導類原球莖的個數/接種外植體數。

1.2.2? “兩步增殖”法使類原球莖增殖? 第一步，將“兩步誘導”法得到的類原球莖切分為單個小球，接種到新的誘導培養基（Y）中培養3周;第二步，將增殖培養第一步得到的類原球莖切割為直徑5 mm左右的小塊，將其放置于液體培養基中，每150 mL三角瓶接種50 g，每處理6瓶，采用L16（45）正交試驗設計對培養基中激素含量、蔗糖含量以及N素比（NH4+∶NO3?）進行比較，篩選適宜的增殖培養基配方。6周后統計類原球莖的鮮重增長量，鮮重增長量（g）=[每處理獲得的類原球莖質量（g）?每處理起始類原球莖接種質量（g）]/每處理樣本數。正交試驗的表頭設計見表2。

1.2.3? 外植體的不同來源比較試驗? 分別選用普通組培苗莖段，經暗處理3周的組培苗莖段，光照條件下腋生莖段，黑暗3周后腋生的白化莖段，4種不同的外植體來源進行比較，按照1.2.1第二步的培養基Y進行培養，再4周后，統計類原球莖的誘導率。

1.2.4? 誘導培養中黑暗處理時間試驗? 采用0、1、2、3、4、5周的暗培養，誘導出白化莖段，將白化莖段放置于培養基為Y1，再4周后比較各處理的誘導效率和總黃酮得率。

1.2.5? 外植體不同處理方式試驗? 將外植體分別采用整個莖段平放、整個莖段斜插、整個莖段埋入、莖段縱切半平放、莖段縱切半斜插、莖段縱切半埋入、莖片平放、莖片斜插、莖片埋入9種方法，放入培養基，按照1.2.1第二步的方法進行誘導，4周后統計誘導率。

1.2.6? 增殖培養時間的確定? 分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8周，每周統計類原球莖的鮮重和干重增長量，確定最適宜生物量增長的培養時間。

1.2.7? 光強對金線蓮類原球莖增殖培養和總黃酮得率的影響? 增殖培養中使用黑暗、弱光（500 lx）、較強光（1000 lx）和強光（2000 lx）4種處理，比較光照強度對類原球莖增殖和總黃酮得率的影響。

1.2.8? 紫外光不同處理時間試驗? 在增殖培養過程中，在光周期中光培養階段紫外燈（SJC-Ⅱ型，60 w，波長253.7 nm）每天照射6 h，分別照射7、14、21、28、35、42、48、56 d。紫外燈不照射的光培養時段日光燈照射（光照時間和強度同1.2.1）。接種量為150 mL三角瓶中接種50 g鮮重類原球莖，8周后測定所得材料的總生物增長量和總黃酮含量，總生物量增長量分為鮮重增長量（g）和干重增長量（g）。干重增長量（g）=[每處理獲得的類原球莖干重（g）–每處理接種時類原球莖干重（g）]/每處理樣本數。總黃酮得率=樣品中總黃酮質量（g）/樣品質量（g）×100%。

1.2.9? 總黃酮的測量? 將培養好的金線蓮類原球莖收集，在烘箱60 ℃干燥3 h后，80 ℃干燥0.5 h，并研成粉末。總黃酮的測量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[15]。分別精確量取蘆丁標準溶液（0.12 g/L）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用30%的乙醇溶液補充至5.0 mL。依次加入0.5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，10%硝酸鋁溶液0.3 mL，1.0 mol/L NaOH溶液4.0 mL，每加入新的試劑混勻后靜置10 min。取混合溶液4.0 mL，分光光度計510 nm測定吸光度。空白溶液為對照，以質量濃度為橫坐標，以吸光度縱坐標，繪制標準曲線。得出線性方程。將金線蓮類原球莖干燥粉末過40目篩，取0.5 g溶于95%乙醇濃度，提取時間24 h，料液比1∶100。取上清液2.0 mL，用30%乙醇補充至5.0 mL，按照標準品同樣的反應程序，最終取反應完的溶液4.0 mL測定510 nm處吸光度。代入線性方程即可得到總黃酮的含量。總黃酮得率=樣品中總黃酮質量（g）/樣品質量（g）×100%。

1.2.10? 與傳統單步誘導法效率比較? 將本研究所用的“二加二”法獲得的誘導率、初始材料擴大倍數、增殖倍數、增殖鮮重、總效率和穩定率分別與傳統單步法獲得的數據進行比較。初始材料擴大倍數=每處理獲得的白化莖段個數/接種外植體數×100%，增殖倍數=每處理獲得的類原球莖個數/起始接種類原球莖個數×100%，總效率=誘導率×初始材料擴大倍數×增殖倍數。穩定率=每處理未分化、未愈傷組織化的類原球莖個數/收獲的類原球莖總個數×100%。

1.3? 數據處理

數據采用Excel 2010軟件和DPS7.05軟件進行統計分析，采用Duncans新復極差法檢驗差異顯著性。

2? 結果與分析

2.1? 外植體來源對金線蓮類原球莖誘導的影響

結果表明，4種不同的外植體，以黑暗腋生白化莖段的平均誘導率最高，可達88.33%，與其他處理差異顯著（p<0.05）。經過黑暗培養的兩個處理比光照條件下的2個處理的誘導率都高，并且差異顯著（圖1）。結果說明，黑暗培養3周能夠顯著促進金線蓮類原球莖的誘導。

2.2? 類原球莖的誘導過程

金線蓮組培莖段經暗培養3周，獲得腋生白化莖段（圖2A）。白化莖段接種后2周，已有部

不同小寫字母表示處理間差異顯著（p<0.05）。1：普通組培苗莖段;2：經暗處理的組培苗莖段;3：光照腋生莖段;

4：黑暗腋生白化莖段。

分莖段萌發出直徑1～2 mm的白色小球（圖2B）。3周后，白色小球逐漸膨大成為球狀或橢圓形的類原球莖，直徑約3 mm;原球莖個數逐漸增多，并且繼續有新的類原球莖萌發（圖2C）。4周后，類原球莖的萌發量最多，以后基本不再有新的類原球莖形成（圖2D）。

有的類原球莖為比較規則的球形，有的為橢圓形，有的為棒狀，有的為不規則形。后續觀察發現，黑暗腋生莖段誘導的類原球莖為球形，顏色潔白，生長速度快，增殖率高，質量最好（圖2E）。橢圓形的類原球莖顏色偏黃，多數帶有小芽，可用于誘導類原球莖再生植株;而棒狀和不規則形的，在生長后期多數為膨大增殖，而且類原球莖生長擁擠變形，有些還發生了玻璃化，不利于后續增殖培養。

與普通組培苗莖段誘導的類原球莖相比，利用腋生白化莖段誘導類原球莖，誘導速度快（2周已有50%以上外植體萌發出類原球莖，而普通莖段此時只有1/3萌發），質量好（圖2B～圖2D，圖2F～圖2H）。

2.3? 誘導培養培養基的確定

供試的9種培養基中，以Y5和Y8的培養基類原球莖誘導率和平均誘導PLB個數顯著高于其他處理。Y8培養基誘導出的類原球莖呈圓形，質量好，后期增殖速度快;Y5培養基誘導率雖然較高，但是長出的原球莖“球”狀不明顯，不夠典型，個別后期培養時增殖緩慢，增殖方式多為膨大，而原球莖個數增加不顯著，并且初期誘導的原球莖體積越大后期越不圓，有伸長分化的趨勢，并且有些發生了玻璃化。因而，Y8培養基最適于誘導類原球莖，效率高，效果好。比較Y1、Y2兩種培養基，兩者在誘導率和平均出芽數方面均沒有明顯差異，說明Y2添加2.0 mg/L KT沒有提高Y1的誘導效果。比較Y1與Y3培養基，Y3的2個指標都低于Y1培養基，可以推測在與6-BA、ZT配比時，NAA比2，4-D更利于類原球莖的誘導。比較培養基Y1、Y2、和Y7、Y9，在沒有6-BA的作用下，Y7和Y9中細胞分裂素ZT的誘導效果明顯降低，即使在Y9中將ZT濃度提升至1.0 mg/L也沒有達到好的誘導效果，推測6-BA較為適宜誘導金線蓮類原球莖，而ZT并不適宜其誘導。比較Y4、Y5、Y6、Y7發現，TDZ作為細胞分裂素加入培養基，與6-BA配合（Y4）不能提高誘導效果;TDZ單獨使用，只有在加入1.0 mg/L S3307（Y5）時顯著提高了誘導效果，而其余3種效果均不理想。誘導效果較好的Y5和Y8中的都含有1.0 mg/L S3307，說明添加1.0 mg/L S3307能夠顯著提高類原球莖誘導效率（圖3）。

不同小寫字母表示平均誘導率的差異顯著（p<0.05），不同大寫字母表示平均誘導個數的差異顯著（p<0.05）。

2.4? 外植體處理和接種方式對金線蓮類原球莖誘導的影響

整個莖段平放是類原球莖誘導率最高的處理方式，誘導率為81.67%，顯著高于其他處理。而3種莖片的誘導處理方式誘導率在9種處理中顯著低于其他處理，說明將莖段切片的處理方式不適宜誘導類原球莖（圖4）。

2.5? 暗培養時間對金線蓮類原球莖誘導的影響

與對照相比3周以上的暗培養能夠顯著促進類原球莖的誘導效率。然而，對培養出的類原球莖的總黃酮得率進行測定，發現暗培養4、5周，類原球莖總黃酮得率有所降低。因而推測，“兩步誘導”階段，適宜類原球莖誘導的初始暗培養時間為3周（圖5）。

2.6? 增殖培養培養基的確定

結果表明供試的16個處理中，處理13的鮮重增長量為35.91 g，且與其他處理差異顯著（表3）。本研究初始接種量為鮮重50 g/150 mL，理論上可獲得類原球莖增殖鮮重239.4 g/L。根據正交試驗極差分析結果顯示，對類原球莖增殖培養中鮮重的增加，培養基中NH4+/NO3是影響最大

不同小寫字母表示差異顯著（p<0.05）。1：整個莖段平放;2：整個莖段斜插;3：整個莖段埋入;4：莖段縱切半平放;5：莖段縱切半斜插;6：莖段縱切半埋入;7：莖片平放;8：莖片斜插;9：莖片埋入。的因素，其次是NAA濃度，再次是6-BA濃度、S3307濃度，影響最小的是蔗糖濃度。最佳實驗配比為：A1B4C4D2E2，即MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA + NH4+/NO3?（15 mm ol∶45 mmol）+蔗糖40 g/L（表4）。經驗證，按最佳實驗配比得到的類原球莖增殖鮮重為246.90 g/L。正交試驗方差分析結果顯示，對于鮮重的增加，5個因素對結果的影響大小順序與極差分析結果一致。并且，各因素p值均小于0.01，各因素對實驗結果的影響均達到極顯著水平（表5）。

2.7? 增殖培養時間的確定

每周統計類原球莖的鮮重和干重增長量，0～6周生物量增長量顯著增高，7～8周較6周有所下降，所以6周是最適宜生物量增長的培養時間（圖6）。

不同小寫字母表示平均誘導率的差異顯著（p<0.05），不同大寫字母表示總黃酮得率的差異顯著（p<0.05）。

2.8? 光強對金線蓮類原球莖增殖培養和總黃酮得率的影響

對于鮮重增長量和干重增長量，光照處理的結果均顯著高于黑暗處理;對于總黃酮得率，弱光（500 lx）和較強光（1000 lx）處理顯著高于黑暗培養處理和強光處理（2000 lx）（表6）。而弱光和較強光處理的3個指標差異均不顯著（表6）。因此，根據經濟原則選擇500 lx的弱光培養有助于類原球莖增殖過程中總黃酮的積累。

2.9? 紫外光處理時間對金線蓮類原球莖增殖培養和總黃酮得率的影響

紫外光處理7～42 d，鮮重增長量與對照沒有顯著性差異，而隨著紫外光處理時間的延長，48 d和56 d的紫外光處理明顯降低了鮮重的增長量（表7）。而對于干重的增長量，紫外光處理只有一個相對降低的趨勢，但差異并不顯著。總黃酮得率受紫外光處理的影響呈現升高的趨勢，42、48、56 d的紫外光照射有利于總黃酮的積累，顯著高于其他處理。因而，為獲得較高的生物量和較高的總黃酮得率，選擇42 d的紫外光照射綜合效果較好（表7）。

2.10? “二加二”法和傳統單步誘導增殖法的培養效果比較

“二加二”法獲得的誘導率、初始材料擴大倍數、增殖倍數、增殖鮮重、總效率和穩定率均比傳統單步法獲得的數據有顯著提升（表8）。誘導率提升至88%的同時，初始材料擴大8.9倍，總效率可提升至27.76。增殖培養中92%的類原球莖不會發生分化和愈傷組織化（表8）。

3? 討論

本研究是在普通單步誘導法莖段誘導途徑的基礎上進行改進。其優勢和創新點包括：誘導培養第一步，每個組培莖段可萌發出多個白化莖段作為誘導材料;誘導培養第二步，與傳統單步法所用的普通組培苗莖段相比，黑暗腋生白化莖段誘導效率更高（88.33%），類原球莖發生早，特征典型，質量更好，本方法在提高誘導率的同時數倍提高初始材料利用率（8.9倍），這也是本方法與傳統單步法的本質區別;增殖培養第一步，將誘導出的類原球莖在原誘導培養基上繼代一次，保證了穩定的生長增殖環境，同時，不需要多次繼代即可達到較好的狀態，縮短了繼代周期;增殖培養第二步，液體懸浮培養增加了類原球莖與培養液和空氣的接觸面積，使生物量顯著增加。正交設計優選的培養基成分配比保證了分化和愈傷組織化的類原球莖比例顯著下降，92%的類原球莖能夠保持穩定增殖。

經暗處理獲得白化莖段的方式，能夠顯著提高類原球莖的誘導效率。前人在不定芽再生研究中也有類似結論[6， 16-17]。但要在第二步誘導培養時轉入光下，因為持續黑暗處理則會影響類原球莖次生物質的積累，總黃酮含量會受到抑制。而弱光下能夠促進總黃酮的積累，這和鄭連金等[18]的研究結果一致。前期暗處理能夠促進誘導率，提高類原球莖的獲得效率，而后期必須要一定強度的光照才能實現類原球莖的生物量和總黃酮的積累。這就要求后期繼續探討如何找到合適的臨界點，使得誘導率和總黃酮積累達到最大化，從而高效獲得總黃酮。本研究得到的適宜類原球莖增殖的光照強度低于文獻[19]中適宜金線蓮組培植株光照強度，推測原因可能是類原球莖本身的生理特點決定的，類原球莖組織材料相比完整組培植株較為幼化，因而誘導類原球莖所需的光照強度較弱。不同類型的光照對金線蓮的生長和總黃酮等藥用成分的積累有顯著影響[20-21]。在周一鳴的研究中發現，C區紫外光（波長200～280 nm）顯著促進苦蕎總黃酮的積累[22]。而本研究使用的紫外燈車發射的紫外光正是C區紫外光（波長253.7 nm），每天6 h，連續42 d，同樣對總黃酮積累達到了良好的促進效果。

對于外植體來源，以往研究中采用的有：種子、組培苗的莖段、莖段切半、莖段切片等[4]。本研究采用的是黑暗處理的腋生莖段，取材方便，獲得率高，而且與種子直接誘導類原球莖相比，材料更多，誘導效率更高。與腋芽誘導的側芽莖尖外植體相比，材料的獲得率高（一個側芽只有一個莖尖，而白化莖段的莖節具有多個）。與莖片相比，操作簡便，并且效率高，獲得的類原球莖質量好。這和韓曉紅等[13]的莖片誘導研究結果不同，其原因可能是，本研究中雖然莖段切片與培養基的接觸面積增加，但破壞了莖段功能的完整性，反而抑制了類原球莖的萌發。此外，產地來源對金線蓮組織培養效果有較大影響[4]。本研究材料為“福建尖葉”，僅比較了該品種利用傳統單步誘導法和“二加二”法的培養效果。今后的研究可擴展到其他品種。

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