澳洲堅果油微乳體系的構建

涂行浩 張帥中 唐景華 杜麗清 帥希祥 張明

摘? 要? 為擴大澳洲堅果油應用領域，構建了澳洲堅果油微乳體系。以微乳區面積為評價指標，采用偽三元相圖法，并結合單因素試驗和Box-Behnken試驗，對表面活性劑、助表面活性劑種類及用量和制備溫度進行優選，并對相圖中O/W型微乳中心區域的兩條可稀釋線上靠近中心的兩個微乳液配方的粒徑測定，評價微乳穩定性。澳洲堅果油微乳液較佳的制備工藝為：吐溫60 （Tween 60）與聚氧乙烯氫化蓖麻油（PEG-40）質量比2.5為混合表面活性劑、聚乙二醇400（PEG400）與澳洲堅果油質量比3.5為混合油相、制備溫度60 ℃，可制備出微乳區面積較大，無色透明并可無限稀釋的微乳液，試驗得到SME為13.61%。微乳液在長期貯存和大量稀釋過程中，粒徑變化較小，穩定性較好。

關鍵詞? 澳洲堅果油;微乳區面積;Box-Behnken試驗;粒徑;穩定性

中圖分類號? TS201.2? ? ?文獻標識碼? A

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）是一種原產于澳大利亞的樹生堅果，也叫夏威夷果，因其果仁風味獨特、營養豐富以及經濟價值高特點，被譽為“干果皇后”。現已在我國熱帶地區廣泛種植，初步統計種植面積已超過150 hm2[1-2]。澳洲堅果果仁中含油70%～80%，且80%以上的脂肪酸是單不飽和脂肪酸，主要以油酸（約60%）和棕櫚油酸（約20%）為主，并含有大量生育酚和角鯊烯等活性成分，具有較高的保健價值及功能特性[3-4]。精制的澳洲堅果油呈淡黃色，除作為功能油脂食用外，還可用于高檔化妝品制造的原料[5]。特別是其脂肪酸組成和與皮脂類似，易于吸收，使它有利于作為皮膚護理產品以及抗衰老面霜的關鍵成分[6-7]。另外，多項研究表明，澳洲堅果油在預防癌癥[8]、降低炎癥[6]和降低膽固醇[9]等方面具有較好的功效。

澳洲堅果油作為一種功能性油脂，受限于其水溶性的影響，市面上產品形式較為單一。為提高澳洲堅果油的溶解度和分散性，可通過制備微乳液、環糊精絡合以及脂質體包封等方法改善。而微乳液具有制備工藝簡單、熱力學穩定以及增溶性好等一系列優點，且在藥物傳導體系已經運用非常成熟，具有較好的應用前景[10-12]。近年來微乳化技術被廣泛應用于常見植物油、色素以及精油等[13-17]的運載和包埋，不僅可以改善其水溶性[18]，還能大幅度提升儲藏穩定性[19]。制備微乳區域越大，意味著在一定范圍內被大量稀釋后，其液滴形態和穩定性可基本保持不變，即穩定性越好[20-21]。本文以澳洲堅果油為油相，借助少量的外部能量如攪拌，以微乳區面積為指標，采用單因素試驗設計、Box-Behnken試驗設計成功構建并優選出可無限稀釋、澄清透明、穩定性好的O/W型微乳液，為將來進一步擴大澳洲堅果油在食品、化妝品等領域的應用范圍提供技術依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料及試劑? 澳洲堅果油：國家重要熱帶作物工程技術研究中心澳洲堅果研發部提供，冷榨制取。

吐溫80（Tween80，TW-80）、吐溫60（Tween60，TW-60）、吐溫20（Tween20，TW-20）、司盤80（Span80，SP-80）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（PEG-40）、甘油、1，2-丙二醇，均為食品級，山東優索化工科技有限公司;聚乙二醇400（PEG 400），醫藥級，山東優索化工科技有限公司;聚蓖麻酸甘油酯（PGPR），食品級，德國Merck公司;無水乙醇、正丁醇、亞甲基藍、蘇丹紅Ⅲ，國產分析純，國藥試劑有限公司。

1.1.2? 儀器與設備? Nano-ZS90粒徑分析儀，英國Malvern儀器有限公司;ETS-D5加熱型磁力攪拌器，德國IKA公司;LVEM5臺式透射電子顯微鏡，Quantum量子科學儀器貿易（北京）有限公司;FV10i激光共聚焦顯微鏡，奧林巴斯（中國）有限公司;ME-104精密型電子天平，Mettler Toledo中國有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 澳洲堅果油微乳的制備? 采用轉相乳化法制備澳洲堅果油微乳。將澳洲堅果油與助表面活性劑混合作為混合油相，分別按不同質量比（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9）與表面活性劑混合均勻，在磁力攪拌的條件下逐滴加入去離子水，記錄體系由澄清透明變渾濁，再由渾濁變澄清透明時轉變點的臨界加水量，計算各組分（混合油相、表面活性劑、去離子水）的質量分數。然后分別以混合油相、表面活性劑、水相為3個頂點，根據各組分質量分數確定臨界點在相圖中的位置，將各點連接起來，繪制偽三元相圖，計算微乳區面積[15-16]。

1.2.2? 微乳類型鑒定及形態觀察? 微乳類型用染色法鑒定[22];形態觀察分別在激光共聚焦顯微鏡及透射電子顯微鏡下進行[11， 23]。

1.2.3? 微乳配方的初步篩選? （1）助表面活性劑的確定。將無水乙醇、1， 2-丙二醇、PEG400、甘油和正丁醇作為助表面活性劑，與澳洲堅果油按照3∶1配比作為混合油相，然后與表面活性劑TW-60/PEG-40（3∶1）混合均勻，按照1.2.1方法制備微乳。通過繪制偽三元相圖，比較各自形成的微乳區面積大小，確定最佳助表面活性劑種類。

（2）單一表面活性劑的初步選擇。在前期預試驗的基礎上，篩選PEG400：澳洲堅果油=3∶1為較佳的混合油相比例，分別以TW-80、TW-60、TW-20、SP-80、PEG-40、PGPR作為表面活性劑，按照1.2.1方法制備微乳。通過肉眼觀察，以外觀均一透明，流動性好為作為微乳形成的標準[19]，按照1.2.1方法制備微乳，1.2.2方法對微乳進行鑒定，初步篩選表面活性劑。

（3）復合表面活性劑的篩選。將上述初步篩選得到的表面活性劑TW-60和PEG-40，分別按照質量比5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5與SP-80復配，固定PEG400/澳洲堅果油（3∶1）為混合油相，按照1.2.1方法制備微乳，比較成乳狀況和最小可稀釋比（The minimum dilution ratio， DR），DR值為微乳擬三元相圖中可稀釋線所對應的混合表面活性劑與堅果油的最小質量比。

1.2.4? 單因素試驗? 按照1.2.1中的方法制備微乳，分別考察TW-60與PEG-40質量比、PEG400與堅果油質量比和制備溫度對澳洲堅果油微乳的微乳區面積大小的影響。

1.2.5? 響應面實驗設計優化微乳配方? 在單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert 8.0.6軟件，按照Box-Behnken中心組合實驗設計原理設計響應面試驗，對澳洲堅果油微乳配方進一步優化。選擇TW-60與PEG-40質量比（A）、PEG400與堅果油質量比（B）、制備溫度（C）三個因素為考察因素，以微乳區面積SME為響應值，確定最佳試驗條件。因素水平如表1所示。

1.2.6? 微乳粒徑及多分散指數（Polydispersity index， PDI）的測定? 采用粒徑分析儀測定堅果油微乳的粒徑大小和PDI值[18]。平行測定3次，結果取平均值。

1.3? 數據處理

所有試驗重復3次，使用Microsoft Excel軟件、Design-Expert 8.0.6軟件和Origin 8.0軟件對數據進行繪圖和統計分析，AutoCAD 2010軟件用于計算微乳區面積。

2? 結果與分析

2.1? 微乳配方初選結果

2.1.1? 助表面活性劑的確定? 在微乳偽三元相圖中，微乳區面積（SME）大小與載油量、成乳能力以及穩定性均密切相關。助表面活性劑通過滲透到表面活性劑分子之間的空隙，從而形成一個無序的混合膜，以此增加微乳界面柔韌性，減少其形成時所需的界面彎曲能，從而形成微乳。一般選擇短鏈醇作為助表面活性劑，且醇的鏈長對微乳的粒徑，分散性和穩定性有著較大的影響[17， 19]。由圖1可知，當以PEG400為助表面活性劑時，形成的SME最大，顯著大于以無水乙醇、1， 2-丙二醇、甘油、正丁醇作為助表面活性劑時的SME（p<0.05），所以選擇PEG400為最佳助表面活性劑。

2.1.2? 表面活性劑初選結果? 微乳制備過程中不同表面活性劑，對微乳的性質及形成能力均有較大影響。DR反映了制備堅果油微乳時表面活性劑的最少用量，因此，以DR為指標，初步篩選最佳的堅果油微乳體系的表面活性劑，結果見表2。對于Tween系列表面活性劑，隨著疏水鏈的長度變短，HLB值增大，越不利于微乳的形成，這與梁蓉等[21]的研究結果一致。表面活性劑的HLB值決定微乳的類型，HLB在3～8的表面活性劑可制備W/O型微乳，HLB在8～18的表面活性劑可制備O/W型微乳[24]?？紤]到單一的表面活性劑不能很好的形成微乳或形成的微乳不穩定，因此在單一乳化劑初選結果的基礎上，通過考察成乳效果和DR值。試驗結果表明，選取TW-60和PEG-40作為復合表面活性劑較為合適。

2.2? 單因素試驗結果

2.2.1? 表面活性劑配比的影響? 將TW-60/PEG- 40分別按質量比5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5混合作為混合表面活性劑，按照1.2方法制備微乳，繪制出擬三元相圖，計算SME，得到的結果如圖2所示。由圖2可知，TW-60與PEG-40在質量比3∶1條件下成乳區域最大，SME顯著高于其他配比，這可能是因為該配比與澳洲堅果油乳化所需的HLB值最接近。所以響應面試驗中選擇TW-60/PEG-40質量比3∶1為中心點進行優化。

2.2.2? 助表面活性劑含量的影響? 將PEG400/堅果油分別按質量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1及5∶1混合為混合油相，按照1.2.1方法制備微乳，繪制出偽三元相圖，計算SME。由圖3可知，隨著PEG400含量的增加，SME明顯增大，當PEG400與堅果油質量比為3∶1時，SME達到最大，這是因為隨著助表面活性劑含量的增加，降低了形成微乳所需的表面活性劑含量[16];繼續增加助表面活性劑，SME反而減小，這可能與形成的微乳體系內部結構有關。在最佳條件下，助表面活性劑正好完全鑲嵌到表面活性劑中，此時形成的微乳結構中增溶空間最大，載油量最大。但是當助表面活性劑增加至過量時，可與表面活性劑的極性端締合使混合膜變得松散，微乳區面積反而減小，而且會導致混合膜強度降低，影響微乳穩定性[19-20]。因此，綜合考慮響應面試驗中PEG400/堅果油質量比為3∶1為中心點進行優化較為合適。

2.2.3? 制備溫度的影響? 制備溫度對微乳區面積的影響如圖4所示。圖4反映了在不同溫度條件下所制備微乳的SME的變化趨勢。當溫度為90 ℃時SME最大，與60 ℃條件下所形成SME差異不顯著，溫度升高對于提升微乳區的面積并不十分明顯，但隨著溫度的進一步升高，由于澳洲堅果油富含不飽和脂肪酸，可能導致微乳中的澳洲堅果油加速氧化，引起變質。因此，綜合考慮選擇微乳的制備溫度60 ℃為中心點進行優化較為合適。

2.3? 響應面試驗及結果分析

2.3.1? 響應面法確定堅果油微乳較佳配方? 將TW-60與PEG-40質量比A（n）、PEG400與堅果油質量比B（k）和制備溫度C（t）經過如下變換：A=（n-3）/2，B=（k-3）/1，C=（t-60）/15后作為自變量，以試驗中繪制偽三元相圖所計算得到的微乳區面積SME（%）為響應值，響應面分析實驗方案及結果見表3，回歸方程方差分析結果見表4。采用Design-Expert 8.0.6軟件，對表3中的實驗數據進行多元回歸擬合，得出以微乳區面積SME（%）為目標函數的二次回歸方程：

表4回歸統計分析結果表明：選取的三個因素對SME的影響順序為：PEG400與堅果油質量比（B）>制備溫度（C）>TW-60與PEG-40質量比（A）。模型的F=13.23，p=0.0013<0.01，表明實驗的二次模型是極顯著的，具有統計學意義。失擬項p值=0.0598>0.05，說明模型不失擬，回歸決定系數R2=0.9445，校正決定系數R2Adj=0.8731，說明該二次多項模型可以解釋87.31%的響應值的變化，模型能夠充分擬合實驗數據。因此，可以利用該回歸方程對SME的變化進行分析。模型中二次項A2、B2對SME的影響極顯著（p<0.01），二次項C2對SME的影響為顯著（p<0.05）;一次項B對SME的影響極顯著（p<0.01），一次項A、C和交互項AB、AC、BC對SME的影響均不顯著（p>0.05），無統計學意義。

明該因素對SME的影響越大，相應表現為SME數值變化的大小。由等高線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處。從圖5能夠看出影響SME最大的因素是B，達到極顯著水平，其次是C和A，表4回歸分析結果也與此相吻合。

2.3.2? 驗證試驗? 通過Design Expert軟件分析確定的微乳液最佳制備工藝為TW-60與PEG-40質量比2.51、PEG400與堅果油質量比3.62、制備溫度63.8 ℃，此條件下SME的理論預測值為14.13%。考慮到實際操作可行性，將工藝條件調整為TW-60與PEG-40質量比2.5、PEG400與堅果油質量比3.5、制備溫度60 ℃，按1.2.1的方法繪制偽三元相圖如圖6所示。試驗得到SME為（13.61±0.42）%，模型預測值為13.74%，與理論預測值相差不大，說明模型可靠，擬合度好，可用于澳洲堅果油微乳液制備工藝參數優化和回歸分析。優化得到的微乳液SME數值與梁蓉等[21]制備的丁香油微乳相當。

2.4? 微乳類型鑒定結果

如圖7所示，在微乳液表面滴加等量染液后觀察，藍色亞甲基藍在微乳中的擴散速度明顯快于紅色蘇丹紅Ⅲ的擴散速度，顏色逐漸擴散到微乳液中表明所制備的澳洲堅果油微乳為水包油（O/W）型。圖8為不同配方微乳樣品，從2個配方樣品外觀可以看出澳洲堅果油微乳液基本為澄清透明的液體。

采用上述試驗方法制備的微乳劑進行形態觀察，激光共聚焦顯微鏡觀察的形態見圖9所示，由圖可知澳洲堅果油微乳成球形，粒徑較小，分布均一;通過透射電鏡觀察觀察微乳形態見圖10所示，由圖可知澳洲堅果油微乳形態規整，電鏡左滴加亞甲基藍，右滴加蘇丹紅Ⅲ。

2.5? 堅果油微乳的粒徑分布及稀釋、貯藏穩定性

為探究澳洲堅果油經微乳包埋后的穩定性情況，分別選擇圖6中O/W型微乳中心區域位置的兩條無限稀釋線上靠近中心的兩個配方點：樣品一：混合表面活性劑（TW-60∶PEG-40=2.5∶1）：混合油（PEG400：堅果油=3.5∶1）：水=12∶3∶35（質量比）;樣品二為：混合表面活性劑（TW-60∶PEG-40=2.5∶1）：混合油（PEG400∶堅果油=3.5∶1）：水=21∶9∶56（質量比），如圖8所示，通過粒徑測定，評估其穩定性。

粒徑大小和分布是微乳性質最主要的評價指標，澳洲堅果油微乳的粒徑分布見圖11，澳洲堅果油微乳的粒徑分布較為理想，平均粒徑為15.23 nm。由表5可知，澳洲堅果油微乳在經過10倍、100倍水相稀釋后，微乳粒徑變化不大，這表明微乳在稀釋過程中粒徑能基本保持恒定，而且微乳稀釋前后的多分散指數PDI（Polydispersity index）值均較小，說明2種配方制備的微乳稀釋穩定性較好。PDI可反應堅果油微乳中粒子的分散寬度，通過粒徑分析儀測定（通過儀器自帶軟件按照國際化標準ISO 13321計算得到）。PDI值在0.1～0.3之間則表示樣品是單分散體系，PDI值越大，體系越復雜，表5中測定的PDI值表明澳洲堅果油微乳是單分散體系。儲藏穩定性也是影響微乳應用的重要因素，試驗通過測定乳液粒徑隨時間的變化情況來表征。由表5可知。在儲藏60 d內，澳洲堅果微乳粒徑變化不大，無明顯差異，PDI值在儲藏過程中也無明顯變化，表明2種微乳均能保持良好的貯藏穩定性。

3? 討論

本研究采用轉相乳化法制備微乳液，通過繪制偽三元相圖，以及單因素試驗和Box-Behnken試驗成功構建澳洲堅果油O/W微乳體系，并確定了微乳較佳配方：TW-60與PEG-40質量比2.5、PEG400與堅果油質量比3.5、制備溫度60 ℃，此條件下形成微乳液的微乳區面積可達13.61%，在DR值為6∶4條件下，澳洲堅果油最大載量占比達到25.0%，并可加水無限稀釋。作為一種經濟價值較高的油脂，該比例已經足夠對其進一步開發應用。通過考察微乳區中心區域的兩個配方樣品在長期儲存、大量稀釋過程中粒徑大小的變化情況，結果表明兩種微乳粒徑變化不大，表明其穩定性良好。另外，儲藏試驗表明粒徑較大的澳洲堅果油微乳至少可貯藏100 d，稀釋前后的多分散指數PDI值均較小，也說明制備的澳洲堅果油微乳液性質穩定。

澳洲堅果油的生物活性功能被越來越多的研究結果所證實，作為一種保健價值較高的功能性植物油脂，市面上關于澳洲堅果油的加工產品以及以往的科學研究僅限于制作堅果油微膠囊、粉末油脂等方面，雖克服了澳洲堅果油易被氧化的不足，但產品為固體狀態，且工業化生產復雜，大大限制了在食品中的進一步應用。本研究提供了一種切實可行的方案，將澳洲堅果油制備成澄清透明、水包油型的食品級微乳液，不但克了服其易氧化和疏水特性，且研究結果表明該微乳液穩定性良好，表現出熱力學穩定、粒徑小、增容性強等優點。另外，整個工藝過程較為簡單，不需特殊設備即可大批量生產，在功能食品以及化妝品領域應用前景良好。

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