頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法分析雞骨香葉揮發性成分

周香露 呂鎮城 徐良雄 彭永宏

摘? 要? 采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法（HS-SPME-GC-MS）研究了雞骨香葉的揮發性成分，在優化HS-SPME萃取條件的基礎上，通過GC-MS從雞骨香葉中鑒定了54個主要組分，并采用峰面積歸一化法測定了各成分的相對含量，主要為反-2-己烯醛（38.62%）、芳樟醇（11.96%）、石竹烯（11.10%）、反-橙花叔醇（6.78%）和β-欖香烯（3.67%）等。其中，醛類化合物占40.37%，烯萜類化合物占36.03%，醇類化合物占21.90%，以及少量的酮類和酯類化合物。

關鍵詞? 雞骨香葉;揮發性成分;頂空固相微萃取法;氣相色譜-質譜聯用法

中圖分類號? R284. 1? ? ?文獻標識碼? A

藥用植物雞骨香（Croton crassifolius Geisel.）是大戟科巴豆屬（Croton）灌木，主要分布在我國福建、廣東、廣西和海南等省份[1]。雞骨香以根入藥，具有性苦、辛、溫的特點，主治胃痛和風濕骨痛等[2]。現代藥理研究表明，雞骨香根及其主要萜類和黃酮成分具有抗炎、抗腫瘤和抑制血管新生等藥理活性[3-4]。前人對雞骨香根的化學成分進行了研究，從中分離鑒定了70多種化合物，主要為萜類、甾醇和有機酸等[5-7]。楊先會等[8]也報道了雞骨香根的揮發性成分，其主要組分為匙葉桉油烯醇（23.7%）、1-表二環倍半水芹烯（6.5%）和2， 4， 5， 6， 7， 8-六氫-1， 4， 9， 9-四甲基- [3aR（3a. α， 4. β， 7.α）]-3H-3a， 7-甲烷甘菊環（5.74%）等，這些成分的生物活性與雞骨香臨床功效基本相符，推測揮發性成分有可能是其有效活性成分之一。

由于雞骨香以根入藥，采挖出來的植株被截取根后，整株植物不可持續生長，地上部分被直接丟棄而造成極大的資源浪費。雞骨香葉片具有濃厚的香氣，但其揮發性成分組成迄今未見報道。為了提高雞骨香藥材的資源利用水平，深入挖掘其非藥用部位的應用潛力，本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法（HS-SPME- GC-MS）分析了雞骨香葉的揮發性成分組成，以期為中藥材雞骨香資源的綜合開發和精油產品開發提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 新鮮雞骨香葉片，于2017年2月份采自廣東惠州，標本經華南師范大學生命科學學院彭永宏教授鑒定為巴豆屬植物雞骨香（Croton crassifolius Geisel.）。

1.1.2? 儀器與設備? 分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司，德國）;氣相色譜-質譜聯用儀7890B- 5977A（Agilent公司，美國）;HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）（Agilent公司，美國）;自動頂空固相微萃取裝置（Agilent公司，美國）。萃取針型號：65 μm PDMS/DVB;50/30 μm DVB/CAR/PDMS;85 μm CAR/PDMS;85 μm PA（美國Agilent公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 萃取針老化? 萃取針分別置于GC-MS進樣口中進行老化，使萃取針進空針時譜圖顯示無雜峰，老化溫度為250 ℃，時間為60 min。

1.2.2? HS-SPME條件? 分別取2.0 g鮮樣研磨后置于20 mL萃取瓶中，加入1.5 mL飽和NaCl溶液后，考察不同極性萃取針：65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm CAR/PDMS、85 μm PA;萃取時間：20、30、40、50、60 min;萃取溫度：40、50、60、70、80 ℃;平衡時間：10、15、20、25、30 min;解吸時間：5、10、15、20、25 min等因素對固相微萃取效果的影響，并采用優化后的固相微萃取條件對雞骨草揮發性成分做進一步的分析。

1.2.3? GC條件? HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm× 0.25 μm）;升溫程序（以60 ℃作為起始溫度，保留5 min;以4 ℃/min升到120 ℃，保留2 min;再以2 ℃/min升到190 ℃，保留2 min;最后以10 ℃/min升到220 ℃，保留2 min）;進樣口溫度為250 ℃;流速為1 mL/min，載氣為He氣，不分流。

1.2.4? MS條件? ?電子轟擊離子源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，傳送接口溫度為250 ℃，掃描范圍50～500 m/z，MS四級桿溫度150 ℃。

1.3? 數據分析

各組分質譜經NIST標準譜庫檢索及峰面積歸一化法計算，確定其組分及相對含量。

2? 結果與分析

2.1? 不同極性萃取針對雞骨香葉揮發性成分萃取效果的影響

萃取針由于各纖維涂層的不同導致其極性不同，因而對各種揮發性成分的吸附能力也有所差別，本研究所用的四種萃取針極性由大到小分別為：PA>CAR/DVB/PDMS>PDMS/DVB>CAR/

P DMS。通過對比4種不同極性的萃取頭所產生譜圖的總峰面積及總峰數目，可以考察不同極性萃取針對雞骨香葉揮發性物質成分的萃取效率。結果表明，PDMS/DVB、CAR/DVB/PDMS和PA三種萃取針萃取的總峰數目差異不大，分別為52個、53個和54個，而CAR/PDMS萃取針萃取的總峰數目最多，達到74個（圖1）。對比各萃取針對萃取總峰面積的影響，發現CAR/DVB/PDMS萃取針萃取的總峰面積是4種不同極性的萃取針中最大的，為3.64×108;最小的為PA萃取針，為1.5×108。總峰面積和總峰數目過小，表明萃取針對樣品的吸附效率低。CAR/ PDMS萃取針總峰面積略低于CAR/DVB/PDMS萃取針，但其總峰數目最多。綜合考慮，選擇CAR/PDMS作為萃取針。

2.2? 平衡時間對雞骨香葉揮發性成分萃取效果的影響

平衡時間即加熱時間，是樣品中的揮發性物質成分在氣相中達到平衡所需要的時間。由圖2可知，當平衡時間為10 min時，總峰面積和總峰數目就已達到較大值，表明此時已經基本達到平衡狀態。隨著時間的延長，總峰數目均在39～40個之間，變化不大。結果提示，在磁力恒溫振搖器振搖的作用下，雞骨香葉的揮發性成分在10 min左右即可達到平衡。因此，選取10 min作為平衡時間。

2.3? 萃取溫度對雞骨香葉揮發性成分萃取效果的影響

溫度是影響分子運動速率的物理因素，溫度高則分子運動速率快，有利于雞骨香葉中的揮發性成分揮發從樣品中加快逸出，反之則慢。從圖3可以看出，隨著溫度的升高，總峰面積呈先升高后降低的趨勢，在溫度為60 ℃時，總峰面積達到最大，為3.16×108。研究表明，造成此現象的原因可能是高溫有利于使難揮發性物質揮發出來以提高被萃取針吸附的概率，但由于萃取針的吸附過程是一個放熱過程，溫度過高不利于揮發性物質吸附于萃取針中，因此隨著溫度的升高，總峰面積出現先升高后降低的現象[9-10]。從總峰數目來看，呈現隨著溫度升高而增多的趨勢，發現當溫度≤60 ℃時，總峰數目均為38個;而當溫度升高到70 ℃和80 ℃時，總峰數目分別為60和66個。有研究指出，采用HS-SPME-GC-MS方法萃取揮發性成分的萃取效果受萃取溫度影響明顯，溫度過低，可能導致樣品中某些組分無法揮發出來，造成揮發不完全;溫度過高，可能造成揮發性成分之間相互發生化學反應，導致分析結果失真[11]。因此，綜合考慮，選取60 ℃作為最佳萃取溫度。

后降低的趨勢，在吸附時間為50 min時達到最大，總峰面積和總峰數目分別為3.06×108和45個。其原因可能是萃取效果受被吸附物質的分子大小和吸附時間長短的影響，化合物的分子質量越小，越容易被萃取針吸附上去，但隨著吸附時間的延長，會由于競爭吸附而使某些組分又解吸附下來[12]。因此，總峰面積和總峰數目均呈現先升高后降低的趨勢。綜合考慮，選擇50 min作為最佳吸附時間。

2.5? 不同解吸時間對雞骨香葉揮發性成分萃取效果的影響

從圖5可以看出，在解吸時間為10 min時，總峰面積和總峰數目已經達到最大值，表明在10 min時，萃取針吸附的樣品已解吸完全。解吸時間過長，有可能導致部分組分的分解，導致檢測結果失真。因此，選擇10 min作為解吸時間。

通過考察不同萃取條件對樣品萃取效果的影響，建立了一種優化的HS-SPME萃取雞骨香葉揮發性成分的方法：鮮樣2.0 g，加入飽和NaCl溶液1.5 mL，萃取針為CAR/PDMS，平衡時間10 min，萃取溫度60 ℃，吸附時間50 min，解吸時間10 min。在此條件下，對雞骨香葉揮發性成分進行分析，總離子流圖見圖6，各組分及其含量見表1。由圖6和表1可知，通過GC-MS 分析、計算機檢索和譜庫比對，從雞骨香葉中共鑒定出54個化合物，主要組分為反-2-己烯醛（38.62%）、芳樟醇（11.96%）、石竹烯（11.10%）、反-橙花叔醇（6.78%）和β-欖香烯（3.67%）等。通過對這些揮發性成分進行歸類，可以看出雞骨香葉揮發性成分主要含醛類化合物（40.37%）、烯萜類化合物（36.03%）、醇類化合物（21.90%）以及少量的酯類和酮類化合物等（圖7）。

3? 討論

本研究應用HS-SPME-GC-MS法分析雞骨香葉的揮發性成分，在優化頂空固相微萃取條件的基礎上，從中鑒定出54種成分，占總峰面積86.7%。從化合物的數目來看，雞骨香葉的揮發性成分比其根的揮發性成分多（33種）[8]。從揮發性成分的構成來看，雞骨香葉的主要揮發性成分為反-2-己烯醛（38.62%）、芳樟醇（11.96%）、石竹烯（11.10%）、反-橙花叔醇（6.78%）和β-欖香烯（3.67%）等，而雞骨香根的揮發性成分主要由匙葉桉油烯醇（23.70%）、1-表二環倍半水芹烯（6.50%）、2， 4， 5， 6， 7， 8 -六氫- 1， 4， 9， 9-四甲基-[3aR（3a. α， 4. β， 7.α）]-3H-3a， 7-甲烷甘菊環（5.74%）、γ-欖香烯（3.02%）、α-蓽澄茄醇（2.44%）等構成，表明雞骨香不同藥用部位揮發性成分存在差異。

在雞骨香葉主要揮發性成分中，含量最高的反-2-己烯醛又稱青葉醛，廣泛存在于蘋果、香蕉、紅茶等80多種食物中。因具有極強的香氣，反-2-己烯醛常被用作人造香料和食品添加劑[13]。研究表明，反-2-己烯醛對辣椒疫霉等植物土傳病原真菌以及南方根結線蟲、禾谷孢囊線蟲等經濟作物重要害蟲具有良好的抑制活性[14-15]。芳樟醇是一種無環單萜醇，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實和全草中，是香水、家用清潔護理產品中使用頻率最高的香料之一，也可用作食用香精。研究表明芳樟醇具有鎮痛、抗炎抑菌以及抗腫瘤等生物活性，目前對其抗炎和抗腫瘤作用機制也有一定的研究[16-18]。石竹烯是雙環倍半萜類化合物，廣泛存在于植物揮發性成分中，如白花前胡、紫蘇、牡荊、黃花敗醬、黃花蒿和老鸛草等[19-20]，常用于人工調香和化妝品[21]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和改善阿爾茲海默癥等作用[22-24]。反-橙花叔醇作為一種常用香料， 不僅廣泛用于許多復合花香的調配中，也可用作食品添加劑和合成藥物中間體[25]。研究表明，反-橙花叔醇能促進阿霉素抗乳腺癌細胞的功效[26]。β-欖香烯的抗腫瘤活性已有較深入的研究，對肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等均有顯著的抑制作用[27-28]。近期的研究表明，β-欖香烯的作用機理是通過激活ERK1/2和AMPKα信號通路而抑制腫瘤細胞的DNA甲基轉移酶的活性[29]。3-蒈烯作為活性成分存在膜苞藁本、川芎、山萘、藏茴香和砂仁等中草藥里，也是珍貴中藥材和重要香料資源佛手精油的主要組分[30]。3-蒈烯本身可作為天然食品用香料直接使用，具有令人愉悅的草本香味，對白紋伊蚊和松墨天牛有趨避作用[31]。β-瑟林烯存在于川芎、細葉艾、人參和西洋參等中藥材里，是海南產沉香揮發油中含量最高的組分[32-35]。研究指出，β-瑟林烯對害蟲栗山天牛有趨避作用[36]。雙環大根香葉烯是一種倍半萜化合物，存在于月桂、佛手和綠心樟等植物中，對人黑色素瘤（B16F10-Nex2）、人膠質母細胞瘤（U-87）和人宮頸癌細胞（Hela）等均有良好的抑制活性[37-39]。

綜上所述，本研究優化了雞骨香葉揮發性成分的HS-SPME萃取條件，并通過GC-MS從中鑒定出54種揮發性成分，其中反-2-己烯醛、芳樟醇和石竹烯等含量高，這些成分具有明確的生物活性。雞骨香葉精油香氣怡人，具有精油開發前景，也有可能開發成為天然調香產品和具有藥用或保健功效相關產品的潛力。

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