白千層精油的化學成分與抑菌活性研究

向亞林 余細紅 趙曉峰 張茂新

摘? 要? 為研究白千層精油的化學成分及其對植物病原真菌的抑菌活性，為環境友好型農藥的研發及白千層的綜合應用提供理論依據。本文采用氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術分析了白千層精油的化學成分，并用菌絲生長速率法測定了白千層精油對4種植物病原真菌的抑菌活性。從白千層精油中分離鑒定出74種化學成分，占總含量的97.28%，其主要化學成分是左旋-α-蒎烯（2.07%）、β-月桂烯（1.05%）、1，8-桉葉素（67.29%）、萜品烯（2.52%）、芳樟醇（2.36%）、α-松油醇（7.93%）和（+）-g-桉葉油醇（1.26%）等。進一步研究表明，白千層精油在5.0～10.0 ?L/mL濃度范圍對立枯絲核菌菌絲生長抑制率為100%;處理2 d時，白千層精油在2.5～10.0 ?L/mL濃度下對小孢擬盤多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的菌絲生長抑制率達71.59%以上，其抑菌作用均隨著處理濃度的增加而增強，隨著白千層精油處理時間的延長，對3種植物病原菌表現出較好的持效性。白千層精油對立枯絲核菌、小孢擬盤多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌均具有較強的抑菌活性，在農用抗菌劑應用中有較好的應用潛力。

關鍵詞? 白千層;精油;化學成分;植物病原真菌;抑菌活性

中圖分類號? S793.931? ? ? 文獻標識碼? A

白千層（Melaleuca leucadendron Linn.），屬桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（Melaleuca）植物，原產于澳大利亞新南威爾士北海岸[1]，目前我國廣西、廣東、福建、海南等地均有較大規模的引種栽培。文獻資料顯示，白千層屬植物次生化合物具有多種生物活性。臧文霞等[2]發現白千層的石油醚萃取物對胃癌細胞、人肺腺癌細胞和肝癌細胞的體外增殖較好的抑制作用;李燕婧等[3]報道互葉白千層（Melaleuca alternifolia Linn.）醇提物具有抗炎、鎮痛、抗菌、抗過敏等藥理作用，且毒性小。現在廣為使用的為白千層屬植物精油（常稱茶樹油），其屬天然油脂，具有消毒、殺菌抑菌、抗病毒、防霉、消炎止痛、化痰止咳等多種活性，可以高效、無毒、無刺激地殺死多種真菌和細菌，對某些病毒也有抑制作用，廣泛應用于藥品、日用衛生制品、皮膚保健品、化妝品、食品香料等諸多領域[4-14]。

在防治植物病害的過程中，長期大量的使用化學合成農藥會帶來環境污染、農殘超標，生態平衡受損、生物多樣性下降等一系列的生態環境問題，因此篩選開發與環境友好的植物源農藥是必然趨勢。不少的研究報道證實植物精油對農業植物病原真菌有抑菌抗菌作用[15-20]，植物精油可以作為新一代植物源農藥開發研究的方向。目前白千層屬植物精油對細菌的作用研究較多，互葉白千層精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌以及白色念珠菌等具有較強的抗菌活性[21-25]。本文旨在研究白千層精油的化學成分及其對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani K?hn）、小孢擬盤多毛孢菌[Pestalotiopsis microspora （（Y2-4））]、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzac Cavgra）和香蕉枯萎病菌[Fusarium oxysporum f. sp. cubense（ （E. F. Smith）） Snyder et Hansen]等4種植物病原真菌的抑制作用，以期為白千層屬植物精油的綜合開發利用和綠色生物農藥的開發研究提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

白千層原液精油：原料源自越南，由英國雪莉派思香薰有限公司（The UK sShirley pPrice aAromatherapy Ltd.）生產。

供試菌種：立枯絲核菌，由廣東省微生物菌種保藏中心提供;小孢擬盤多毛孢菌，由中國熱帶農業科學院廣州實驗站鄭麗博士提供;水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌，均由華南農業大學資源環境學院植物病理室李敏慧博士提供。供試病菌用PDA培養基（廣東環凱微生物科技有限公司生產）培養備用。

儀器與設備：Agilent 7890B-5977A氣質聯用儀，美國安捷倫公司;LRH-250A生化培養箱，上海常思工貿有限公司;DGX-9143BC-1電熱鼓風干燥箱，上海滬粵明科學儀器有限公司;YXQ- LS-50SII立式高壓滅菌器，上海博迅實業有限公司;FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SW-CL-2FD凈化工作臺，上海譜振生物科技有限公司等。

1.2? 方法

1.2.1? 白千層精油化學成分分析? 采用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對白千層精油進行化學成分分析，在華南農業大學測試中心完成。樣品的處理：取1 μL揮發油，用無水乙醚稀釋成1 mL溶液，采用GC-MS對揮發油進行分析。GC條件：石英毛細管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫速率，升溫到260 ℃，然后保持至完成分析，載氣為He（99.99%），柱流量 1. 0 mL/min，壓力28.8 kPa，進樣口溫度250 ℃，不分流。MS條件：EI源，電子能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，采集質量范圍35～-500 amu。樣品經氣相色譜質譜分析，各分離組分采用NIST14譜庫檢索（匹配度大于90%），并結合人工解析和參考文獻加以確認其化學成分。相對含量采用色譜峰面積歸一化法計算。

1.2.2? 白千層精油抑菌活性測定方法? 用瓊脂稀釋法結合菌絲生長速率法[26]，測定白千層精油對供試病原真菌菌絲生長的抑制作用。用移液槍準確吸取適量精油與0.1%吐溫--80無菌水溶液混合，充分乳化后加入到10 mL已冷卻至50 ℃的PDA培養基中，配制得到2.5、5.0、7.5、10.0 ?L/ml 4個濃度處理，反復振蕩搖勻后小心倒入無菌培養皿，制備不同濃度的PDA培養平板。以僅加入0.1%吐溫--80無菌水溶液的PDA培養基為空白對照處理。取在PDA平板上預先培養的供試病原菌，從菌落邊緣用直徑8 mm的無菌打孔器切取菌餅，并將其移植到上述不同體積分數的精油平

板和空白對照中央。每個處理3次重復。將培養皿置于28 ℃的恒溫培養箱內培養6 d。從第2 d開始，用相交垂直線法每2 d測量一次供試菌菌落的直徑，并對結果進行統計分析。按下列公式計算菌絲生長抑制率。

參照馬萱等[27]方法，通過抑制率的大小判定白千層精油對各菌落的抑菌活性等級：相對抑制率達70%以上為較強抑制;相對抑制率達40%～ 70%為中等強度抑制;相對抑制率達40%以下為較弱抑制。

1.3? 數據處理

實驗數據采用Excel軟件整理，SAS軟件統計分析，差異顯著性采用鄧肯氏新復極差法檢驗（DMRT，p<0.05）。

2? 結果與分析

2.1? 白千層精油化學成分GC-MS分析

通過GC-MS分析白千層精油的化學成分，并通過標準圖譜庫對比和檢索圖譜分析，鑒定出74種化學成分，并計算出各成分的相對含量，鑒定出匹配度90%以上的化合物含量占總揮發油成分的97.28%。測得的化學成分涵蓋了烯、醇、酮類。由表1可知，白千層精油中較大峰的保留時間分別在7.427、9.104、10.616、11.153、12.372、15.079和26.195 min，其化學成分分別是左旋-α-蒎烯（2.07%）、β-月桂烯（1.05%）、1，8-桉葉素（67.29%）、萜品烯（2.52%）、芳樟醇（2.36%）、?α-松油醇（7.93%）和（+）-g-桉葉油醇（1.26%），這7種化合物總含量占到總揮發油成分的84.48%。

2.2? 白千層精油對4種植物病原真菌的抑菌活性

從圖1和表2可以看出，白千層精油處理對小孢擬盤多毛孢菌、立枯絲核菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌均表現出較強的抑菌活性。從圖1可以看出，處理6 d，對照處理的小孢擬盤多毛孢菌、立枯絲核菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌菌絲體幾乎長滿了整個培養皿（（圖1中A0、B0、C0、D0）圖1中A0、B0、C0、D0），而白千層精油各濃度處理的4種植物病原菌菌絲生長均明顯小于對照（（圖1中A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4）圖1中A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4）。

從表2可以看出，白千層精油對立枯絲核菌菌絲生長具有更強的抑菌活性。白千層精油處理2 d，在2.5～10.0 ?L/mL濃度處理的菌絲生長抑制率均達到100%。在2.5～5.0 ?L/mL時，白千層精油除了2.5 ?L/mL濃度處理的菌絲生長抑制率降為85.87%外，其他濃度處理對立枯絲核菌菌絲生長的抑菌率均為100%，表現出很好的抑菌持效性。

處理2 d時，白千層精油在2.5～10.0 ?L/mL濃度下對小孢擬盤多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的菌絲生長抑制率達71.59%以上，其抑菌作用均隨著處理濃度的增加而增強，表現出明顯的濃度效應。隨著白千層精油處理時間的延長，對3種植物病原菌仍然表現出較強的抑菌活性。處理4～6 d時，白千層精油除了2.5 ?L/mL濃度處理外，其余各濃度處理的菌絲生長抑制率均在70.82%以上，表現出對小孢擬盤多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等3種植物病原菌較好的抑菌持效性。

從表2可以看出，白千層精油處理2 d時，2.5 ?L/mL下4種病原真菌間的抑菌作用差異顯著，對立枯絲核菌的抑制率達100%;5.0 ?L/mL下立枯絲核菌與另外3種病原真菌間的差異顯著;7.5 ?L/mL、10.0 ?L/mL對4種病原真菌表現出完全抑制效果。處理4 d和6 d時，仍以對立枯絲核菌的抑制效果最佳，不同病原真菌間的抑制效果存在不同差異。

3? 討論

本文研究采用氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用（GC-MS）手段分離鑒定出白千層精油含有74種化學成分，占總揮發油量的97.28%，其主要化學成分是1， 8-桉葉素（（67.29%））、α-松油醇（（7.93%））、萜品烯（（2.52%））、芳樟醇（（2.36%））、左旋-α-蒎烯（（2.07%））、（+）-g-桉葉油醇（（1.26%））和β-月桂烯（（1.05%））等。本文白千層精油檢出的成分及其含量與文獻存在一定差異，劉布鳴等[28]從白千層揮發油中檢出確認了35種成分，其主要化學成分為松油醇-4（（33.58%））、α-松油烯（（10.12%））、1， 8-桉葉素（（6.08%））、γ-松油烯（（18.05%））、β-月桂烯（（1.05%））等;董曉敏等[29]從廣西產白千層的揮發性成分中確認了47種成分，主要化學成分包括1， 8-桉葉素（（40.64%））、α-蒎烯（（14.74%））、α-松油醇（（8.71%））、愈創木醇（（4.30%））、石竹烯（（3.63%））、喇叭茶醇（（2.14%））、石竹烯氧化物（（1.92%））、β-蒎烯（（1.69%））等;海口產的白千層枝和葉的揮發油主要成分和含量也存在差異，白千層枝的揮發油中以芳樟醇（（3.79%））、桉葉油醇（（2.31%））、β-松油醇（（2.22%））、α-杜松醇（（2.19%））、β-蒎烯（（2.13%））、α-松油醇（（1.78%））、α-蒎烯（（1.04%））、松油醇-4（（1.02%））、綠花白千層醇（（1.01%））等為主，而白千層葉揮發油主要成分為松油醇-4（（27.43%））、1， 8-桉葉素（（19.37%））、α-松油醇（（8.27%））、石竹烯（（3.79%））、β-蒎烯）（1.39%））、α-蒎烯（（1.24%））等[30]。這些差異的存在可能與白千層產地環境、栽培時間、采集時間、采集部位、測定條件等有一定關系。本精油中1， 8-桉葉素的相對含量高達67.29%，而松油醇-4（（即4-萜品醇））只有0.78%，故屬于桉型茶樹油[31]。1， 8-桉葉素廣泛用于食品、醫藥、日用化工等領域，具有明確的藥用價值和一定的消耗量[32];研究發現1， 8-桉葉素在50 μg/mL對沙門氏菌（Salmonella enteritidis）有抑制效果，是茶樹油的主要抑菌成分[33];鐘振聲等[22]認為1， 8-桉葉素為抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的有效物質。α-松油醇對多種革蘭氏菌和多種真菌具有較強的抑制作用[34-36]，如α-松油醇能明顯抑制意大利青霉菌絲體生長[37]。實驗證明芳樟醇有顯著的抑菌活性[38-39]，天然芳樟醇對柑橘炭疽病菌、蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麥赤霉菌表現出較強的抑菌活性[40-41]，薰衣草精油組分芳樟醇對抑制金黃色葡萄球菌貢獻最大[42]。α-蒎烯對白念球菌有明顯的抑菌和殺菌作用[43]，研究發現20 ?L/mL的1s-α-蒎烯可完全抑制大腸桿菌;50 ?L/mL的1s-α-蒎烯、β-月桂烯可完全抑制枯草芽孢桿菌生長[44]。

本文研究結果表明，白千層精油對立枯絲核菌、小孢擬盤多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等4種植物病原菌的生長均具有較強的抑制作用，抑菌作用隨精油濃度的增大而增強，且具有較好的持效性。白千層精油處理立枯絲核菌，在5.0～10.0 ?L/mL濃度范圍均可完全抑制立枯絲核菌菌絲生長;在7.5～10.0 ?L/mL濃度范圍可完全抑制小孢擬盤多毛孢菌菌絲的生長;在10.0 ?L/mL濃度時可完全抑制水稻稻瘟菌菌絲的生長。其余濃度處理下，白千層精油對立枯絲核菌、小孢擬盤多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等4種植物病原菌的生長均具有較強的抑制作用。張麗等[19]和朱德明等[17]的研究結果顯示互葉白千層精油對芭蕉炭疽菌、香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌具有良好的抑菌效果，能顯著性抑制芭蕉炭疽菌菌絲生長，可導致其分生孢子內部構造發生改變。陶鳳云等[18]研究結果表明白千層精油對水稻惡苗菌、尖孢鐮刀菌和水稻紋枯菌等3種植物真菌菌絲生長的抑制作用顯著。由此可見，白千層精油抗菌抑菌活性具有一定的廣譜性，可作為開發新型抗菌抑菌劑的來源材料。

本文開展了白千層精油化學成分研究分析和其對4種常見植物病原真菌的抑菌活性測試，但白千層精油對其他植物病原菌的抑菌活性、最小抑菌濃度、殺菌機理以及白千層精油中存在抑菌活性的單體化合物篩選確定等方面問題還需要在后續工作進行深入研究。

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