細菌纖維素高產菌株的篩選及鑒定

摘要：細菌纖維素具有高結晶度、生物可降解性和合成可調控性等優良特性，被公認為是一種性能較好的纖維素，廣泛應用于食品、醫學、造紙、聲學等領域。筆者在研究中發現，實驗室自制蕎麥醋自然放置一段時間后，液面上長出厚厚的凝膠狀膜，經成分分析，確定該膜成分為纖維素，結晶度為78%，Iα型纖維素含量為60%。取該蕎麥醋的醪液，經富集、分離、初篩和復篩等，最終從108個單菌落中篩選出1株性能穩定的纖維素高產菌株J2，纖維素產量可達 8762 g/L（濕質量）。通過形態學與基于16S rRNA序列的分子生物學鑒定，確定菌株J2為漢森氏葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter hansenii，GenBank登錄號為GU213109）。

關鍵詞：細菌纖維素；菌株；鑒定；漢森氏葡糖醋桿菌

中圖分類號： S182文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0282-04

收稿日期：2016-10-19

基金項目：陜西省科技廳自然科學基礎研究計劃（編號：2016JQ3036）。

作者簡介：葛含靜（1981—），女，陜西咸陽人，博士，講師，主要從事糧食工程與發酵技術創新、食品化學與營養學等方面的研究。E-mail：gehanjing1981@163com。

細菌纖維素（bacterial cellulose，簡稱BC）是某些海洋生物（如被囊綱動物）、細菌（醋酸桿菌、假單胞桿菌、土壤桿菌、無色桿菌、八疊球菌等菌屬的細菌）代謝產物，由β-1，4-D-吡喃葡萄糖聚合而成，不摻雜任何其他形式的多糖，純度極高。與普通植物纖維相比，BC機械強度高、吸水保水率高、生物適應性良好，被認為是性能較好的纖維素，廣泛應用于食品、醫藥、造紙、石油開采等領域。

目前，學術界對BC的合成研究主要是圍繞培養基及培養條件的優化、菌株的代謝工程改造、高產菌株的自然選育及誘變選育等方面展開。陳軍等利用糖廠副產物——酸化糖蜜生產BC，發現產量顯著提高，且用紅茶菌的復合菌種能更高效地利用碳源[3]。夏露等利用甲醇廢水發酵生產BC，發現以木醋桿菌靜態發酵，BC產量較低[4]。楊雪霞等研究發現，剪切力會影響纖維素產生菌的形態和生物量，不利于BC合成[5]。翁媛媛等以惰性吸附載體固態發酵生產BC，在避免剪切力的同時，增加了固液界面的表面積，BC產量為液態靜置發酵產量的3倍，但后處理難度增加了很多。de Melo等對漢森氏葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter hansenii） ATCC23769纖維素合成酶操縱子中部分基因進行克隆，采用過表達這些基因以期提高BC產量。周勝虎等從腐爛的水果中自然分離得到BC產生菌JX303335[8]。余曉斌等通過紫外誘變[9]，杜雙奎等通過高靜水壓誘變方法[10]實現了BC高產突變株的成功選育。盡管BC生物合成的研究在各個方面都取得了長足進展，但從源頭上自然篩選出性能穩定的BC高產菌株，優化其發酵條件，表征其產BC性能相關指標，仍具有重要的研究意義。本研究初步篩選出了1株BC產量高且傳代穩定的菌株J2，并擬對其進行鑒定，同時，擬對菌株J2所產BC的超微結構和超分子結構也作鑒定，為后續通過誘變或基因工程方法選育優良的BC產生菌株奠定基礎。

1材料與方法

11試驗材料

本試驗所用材料為筆者所在實驗室自制蕎麥醋。

12試驗試劑

細菌基因組提取試劑盒、2 000 bp DNA marker、Ex Taq酶，均購自日本TaKaRa公司。DNA膠純化及回收試劑盒，購自美國Amersham Biosciences公司。細菌16S rRNA通用擴增引物F9/R1510及測序引物F9、R1510和F520，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他試劑均為分析純級或生化試劑級。

13培養基

富集培養基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，10 g/L MgSO4·7H2O，無水乙醇體積分數為2%，005 g/L 制霉素，pH值自然。

基礎種子培養基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，15 g/L MgSO4·7H2O，無水乙醇體積分數為2%，pH值自然。分離培養基、斜面保藏培養基配方在基礎種子培養基的基礎上加17%瓊脂。

基礎發酵培養基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，10 g/L MgSO4·7H2O，無水乙醇體積分數為2%，pH值自然。

所有培養基均于121 ℃高壓滅菌15 min后備用。

14方法

141菌種篩選[11]富集：自制蕎麥醋于自然條件放置一段時間，液面長出厚厚的凝膠狀膜。經成分分析，確定為BC。吸取10 mL該醋樣，加到90 mL富集培養基中，30 ℃培養 4 d，培養基表面長出BC。

分離：吸取1 mL長膜的富集培養液，用無菌生理鹽水稀釋成濃度梯度為10-1、10-2、…、10-7的溶液。吸取后3個濃度梯度的稀釋液各02 mL，涂布于分離培養基平板，30 ℃培養5 d，選擇菌落長勢良好、分布均勻且菌落數適中的1個平板，挑取所有單菌落，接種于斜面培養基，30 ℃培養18～24 h，長出豐厚菌苔后，保藏于4 ℃冰箱。

初篩：將保藏的菌種各挑取1環，分別接種于10 mL基礎發酵培養基，30 ℃培養5 d，篩選產BC的菌株，挑取其菌膜，連續2次劃線分離，鏡檢為純培養物后，斜面保藏于4 ℃冰箱。

復篩：挑取純化的菌株接種于基礎種子培養基，連續5代傳代培養，測定每代菌株產生的BC濕質量，篩選出產量最高且穩定的菌株。培養方法：挑取1環活化的斜面菌苔，接種于100 mL基礎種子培養基，30 ℃、130 r/min振蕩培養24 h進行活化，再接入基礎發酵培養基進行發酵培養，測定BC產量。

BC產量的測定：將活化的種子液按10%接種量（體積分數）接入1 L發酵培養基，用8層滅菌紗布封口，30 ℃靜置培養5 d，測定處理后的BC產量。BC處理方法：用蒸餾水過夜沖洗BC膜，然后浸泡于05 mol/L NaOH溶液中并煮至乳白色半透明狀[12]。處理后的BC膜在濾紙上瀝干，稱質量（即BC濕質量）；將瀝干的BC膜在烘箱中于105 ℃烘至恒質量，稱質量（即BC干質量）。纖維素產量用單位體積培養液的纖維素質量表示。

142凝膠狀膜成分分析[11]定性分析：在培養皿中放入1張新的載玻片，倒入蒸餾水，能覆蓋載玻片即可。挑取培養 2 d 的凝膠狀膜，自然平展于載玻片上，取出載玻片并晾干，向膜上滴665%硫酸，然后用碘液染色，在顯微鏡下觀察顯色情況。

酶解試驗：取凝膠狀膜，于105 ℃烘干至恒質量，準確稱取0500 0 g，剪碎，加入纖維素酶溶液中，55 ℃長時間保溫，若溶液變清亮且烘干后膜的質量減輕90%以上，則可確定凝膠狀膜主要成分為纖維素。

143BC結構鑒定超微結構表征：用掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscope，簡稱SEM）觀察。BC干膜用雙膠碳導電帶安裝在1截銅段上，用鉑涂層設備為BC膜涂鉑，室溫進行掃描電鏡拍照。

超分子結構表征：用固態13C-核磁共振光譜（muclear magnetic resonance，簡稱NMR）測定過夜水洗并烘干的纖維素的結晶度、晶體類型。測試頻率7546 MHz，脈沖寬度 38 kHz，接觸時間1 ms，轉子轉速5～6 kHz，轉角547°，循環時間3 s，每個光譜2 400次掃描。

144菌種鑒定形態學鑒定：取對數期菌體，結晶紫染色后用光學顯微鏡觀察菌體形態；同時，取對數期菌體劃線接種于種子培養基平板，30 ℃培養3～5 d，觀察菌落形態。

分子生物學鑒定：用細菌基因組提取試劑盒提取BC產生菌株基因組DNA。以基因組為模板、F9/R1510為引物擴增16S rRNA序列。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。序列在美國國立生物技術信息中心（NCBI）的核酸數據庫中進行BLAST同源性比對，用MEGA4繪制系統發育樹，結合表型特征確定其生物學地位。

2結果與分析

21BC產生菌株篩選

涂布分離得到108個單菌落（依次編號為J1，J2，…，J108）。初篩發現，有9株菌能產凝膠狀膜，3株所產凝膠狀膜松軟、有空洞。對能產膜的9株菌連續5代傳代培養，發現編號J2的菌株的每一代培養物性狀穩定、凝膠狀膜產量最高（平均為8762 g/L），且膜外觀結實、平滑、有彈性。

22凝膠狀膜成分分析

被染色為深藍色的物質在顯微鏡下呈無規則層狀分布，包裹著未染色的桿狀菌體細胞。初步判斷，凝膠狀膜主要成分為纖維素。酶解50 h后溶液變清亮，酶解前膜質量 0500 2 g，酶解后質量0023 6 g，因此可以算出，纖維素含量為（0500 2～0023 6）/0500 2×100%=9528%。可以判斷，凝膠狀膜的主要成分為纖維素。

23BC結構鑒定

超微結構：如圖1所示，堿煮處理的BC中菌體殘留更少；水洗與堿煮后BC超微結構沒有變化，說明純化方法對纖維素的微觀結構沒有影響，這與McKenna等的研究結果一致。此外，BC的微纖維直徑不足01 μm，呈密集網狀，很多根微纖維組成纖維絲帶，進而形成不計其數的不規則、相互疊加的孔穴，即三維網狀結構。這種結構持水保水性能良好，也有利于吸附有機試劑，因而BC可用作吸水材料和吸附材料，用于食品加工及藥物緩釋體系中[14]。

超分子結構：對比天然纖維素的NMR圖譜（圖2），圖3中信號均為纖維素信號，說明菌株J2所產BC純度高，進一步測定發現，該纖維素結晶度達78%，Iα型纖維含量達60%。生物材料的結晶度與其拉伸性能、尺寸穩定性及密度呈正相關[15]，因此可知，菌株J2所產BC拉伸性能及尺寸穩定性良好、密度高。Iα型是纖維素的亞穩態結構，在一定條件下可轉化為穩定的Iβ晶型，BC具有很強的生物適應性且在環境中易于分解，很可能是由于其中Iα型纖維含量高[16]。因此，與高等植物相比（后者Iα型纖維含量為30%[17]），菌株J2所產BC生物適應性良好。

24菌種鑒定

241形態學鑒定J2菌體細胞呈桿狀，單個或成對，大小為（212～418）μm×（081～092）μm；菌落呈圓形，表面光滑，凸起，不透明，乳白色，大小為09～14 mm，詳見圖4，可初步判斷菌株J2為醋酸桿菌屬。

242分子生物學鑒定對菌株J2進行16S rRNA序列擴增及系統發育分析，如圖5、圖6所示，菌株J2與菌株Ga hansenii NBRC14817、Ga hansenii NBRC14816和Ga hanseniiNBRC14820同支，相似度達100%。

微生物的分類鑒定從來沒有一個黃金指標。表型特征雖然可進行表型分群，但分類學結果不夠精準，因而只能用于描述微生物的表型性狀特征。遺傳學分類法，即根據核酸分析得到的遺傳相關性所作的分類，以決定生物表型特征的遺傳特征DNA和RNA作為比較的準繩，是一種更客觀和高度可信的分類方法。因此，表型鑒定與遺傳學分類法結合，可以更為準確地對未知微生物進行分類鑒定。結合形態學鑒定與基于16S rRNA序列擴增的分子生物學鑒定，即可確定菌株J2是漢森氏葡糖醋桿菌（Ga hansenii）。

3結論

本研究以筆者所在實驗室自制蕎麥醋為材料，將該蕎麥醋放置一段時間后，從其表面凝膠狀膜中自然分離出1株性能良好的BC高產菌株J2，其BC結晶度為78%，Iα型纖維含量為60%，表明BC密度高，拉伸性、尺寸穩定性和生物適應性均良好。通過形態學鑒定與基于16S rRNA序列的分子生物學鑒定，確定菌株J2為漢森氏葡糖醋桿菌（Ga hansenii）。

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