高效液相色譜法測定雞血漿中恩諾沙星和環丙沙星含量

鄭育基等

摘? 要：為了研究雛雞血漿中恩諾沙星和環丙沙星含量及代謝規律，建立了本HPLC方法。血漿樣品中的藥物采用乙腈提取和凈化，熒光檢測器檢測，激發波長278nm，發射波長450nm;流動相為0.05mol/L磷酸/三乙胺-乙腈（82：18，V/V）溶液。結果表明，血漿中恩諾沙星和環丙沙星的含量在0.05～10mg/L濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數大于0.999。在低、中、高三個添加濃度（0.05、0.5、10mg/L）下平均回收率在87.26%～106.36%之間，日內變異系數低于8.97%，日間變異系數低于7.92%，檢測限和定量限分別為0.01mg/L和0.05mg/L。本方法建立的血漿提取凈化和檢測條件可用于準確測定雞血漿中恩諾沙星和環丙沙星的含量。

關鍵詞：HPLC;恩諾沙星;方法學;雛雞

氟喹諾酮藥物因其抗菌譜廣、殺菌作用強、吸收快、體內分布廣與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點，廣泛用于人醫臨床與養殖業中[1]。生產上雞白痢、雞傷寒、雞副傷寒和雞支原體等病原體可通過種蛋感染雛雞。目前唯一批準在雛雞上使用的抗生素是頭孢噻呋注射液，恩諾沙星是動物專用抗生素，對上述細菌感染有很好療效[2]，同時部分藥物在雞體內代謝為環丙沙星[3]。目前恩諾沙星的檢測方法有微生物法[4]、高效液相色譜法[5]和超高效液相串聯質譜法等[6]。本文在前人報道的基礎上[7～9]，通過色譜條件和血漿樣品處理的優化，建立了雛雞血漿中恩諾沙星和環丙沙星含量的HPLC方法，為進一步研究恩諾沙星注射液在雛雞體內藥動學特征和臨床合理利用提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 儀器和試劑? Waters 2695高效液相色譜儀（Waters 2695，配Waters2475熒光檢測器），購自美國Waters公司;純水儀（UPH-11-20T），購自四川優普超純科技有限公司;KQ-250B型超生波清洗器（KQ-250B型），購自昆山市超聲儀器有限公司;氮吹儀（N-EVAP），購自美國Organomation公司;漩渦混合器（WH-3），購自上海滬西分析儀器廠有限公司;電子分析天平（BS124S），購自德國賽多利斯天平公司;高速冷凍離心機（5810R）、移液槍，購自德國Eppendorf公司。

恩諾沙星與環丙沙星標準品（PHLC≥99.5%），批號分別為H0081505、H0101310，購自中國獸醫藥品監察所;乙腈、甲醇均為色譜純，美國天地有限公司生產;85%濃磷酸，德國CNW公司生產;氫氧化鈉、三乙胺為分析純，國藥集團生產;水為超純水。

1.2? 溶液配制? 精密稱取恩諾沙星、環丙沙星標準品各10.05mg，分別置于10ml棕色容量瓶中，用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解。

1.2.1? 標準溶液母液配制? 甲醇定容濃度為1mg/ml的儲備液，放置于4℃下保存備用，有效期6個月。

1.2.2? 0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液配制? 取濃磷酸3.4ml，用水稀釋至1L，用三乙胺調pH值至3.0，備用。

1.2.3? 流動相的配制? 準確吸取18ml乙腈和82ml 0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液，渦旋混勻，備用。

1.2.4? 標準溶液工作液的配制? 準確量取適量環丙沙星、恩諾沙星標準儲備液，用流動相稀釋成適宜的混合標準工作液，置2～8℃冰箱中保存。

1.3? 血漿樣品處理? 準確吸取0.2ml新鮮或凍融的血漿樣品于1.5ml刻度離心管中渦旋1min混勻后靜置10min，加入1ml乙腈，渦旋振蕩3min，12000r/min離心10min。上清液移至10ml刻度離心管中，45℃氮氣吹干溶劑流動相復溶，渦旋振蕩1min，2000r/min離心1min，上清液經0.22μm濾膜過濾，取濾液，即得。

1.4? 色譜條件? 色譜柱：Agilent HP-C18（4.6×250mm，5μm）;流速：0.8ml/min;柱溫：35℃;進樣量：10μl;流動相：0.05mol/l磷酸/三乙胺（pH=3.0），乙腈（82：18，V/V）;熒光檢測器：激發波長278nm，發射波長450nm。

1.5? 標準曲線的繪制? 準確吸取混合標準工作液，分別制得0.05、0.5、1、4、6和10mg/L混合標準溶液系列添加濃度。乙腈提取，氮氣吹干流動相復溶，過0.22μm濾膜上機檢測。

1.6? 檢測限和定量限? 制備5個平行空白血漿，按照1.3項下的血漿樣品處理方法處理后，上機測得平均基線噪音值。準確吸取混合標準工作液，制得0.005、0.01、0.05和0.1mg/L添加濃度，按1.4色譜條件進樣分析。取信噪比S/N≥3時樣品的最低濃度為檢測限（LOD），以信噪比S/N≥10時樣品的最低濃度為最低定量限（LOQ）。

1.7? 回收率和精密度的測定? 準確取混合標準工作液，制得0.05、0.5、10mg/L三個濃度的添加樣品，按1.3項下血漿樣品預處理方法處理后供HPLC分析，確定其峰面積與相應的標準品直接進樣的峰面積進行比較，計算回收率。

準確取混合標準工作液，分別制得0.05、0.5、10mg/L三個濃度的空白血漿添加樣品，混勻后按“1.3”項下血漿樣品預處理方法處理后，按1.4色譜條件進樣分析，確定其峰面積。每個濃度水平設5個平行（日內），共重復考察3批（日間），計算出日內和日間變異系數。

1.8? 干擾性試驗? 照上述血漿處理辦法及色譜條件，分別取空白血漿、混合標準樣品、空白加標樣品、實測樣品各10μl進行測定。

1.9? 實際樣品檢測? 10只體重約50g雛雞頸部皮下注射恩諾沙星2mg/只，24h心臟采血1.5ml分裝于抗凝管中，3000r/min離心10min分離出血漿，于-20℃凍存，待測。

2? 結果與分析

2.1? 標準曲線及線性關系考察? 以色譜峰面積（S）為橫坐標，以藥物濃度（C）為縱坐標，繪制標準曲線。將數據進行線性回歸，分別得到恩諾沙星與環丙沙星線性回歸方程分別為：y=192513270.7x-112679.8;y=89631925.1x+36913113.7。結果表明，兩者在0.05～10mg/L范圍內呈良好線性關系，見表1。

2.2? 檢測限與定量限? 在本試驗建立的色譜條件下，血漿樣品中的恩諾沙星和環丙沙星的檢測限、定量限分別為0.01mg/L和0.05mg/L。

2.3? 回收率和精密度? 回收率和精密度測定結果見表2。結果環丙沙星與恩諾沙星低、中和高三個空白血漿添加濃度（0.05、0.5、10mg/L）下的平均回收率在87.26%～106.36%之間，日內變異系數低于8.97%，日間變異系數低于7.92%，符合《獸藥質量標準分析方法驗證指導原則》要求。

2.4? 干擾性試驗? 在1.4色譜條件下，恩諾沙星、環丙沙星藥峰峰型良好與血漿中其他組分無干擾。環丙沙星和恩諾沙星的出峰時間分別為7.1min和9.0min左右。空白血漿、混合標準樣品、空白血漿加標和實測樣品色譜圖見圖1～4。

2.5? 實際樣品檢測結果? 取5份恩諾沙星注射液皮下給藥24h后血漿，采用本方法進行檢測，測得的恩諾沙星平均濃度為0.96mg/L，環丙沙星未檢出;按農業部1025號公告-14-2008《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》的色譜條件，血漿采用本文處理辦法，測得恩諾沙星平均濃度為0.91mg/L，環丙沙星未檢出。

3? 討論與結論

3.1? 提取條件的優化? 目前有關于氟喹諾酮類抗生素血漿中的提取主要通過甲醇[10]、乙腈[11]和乙酸乙酯等有機溶劑。本試驗分別以1ml甲醇和乙腈對標準添加樣品進行提取，結果顯示采用甲醇和乙腈提取的回收率均達到85%以上無明顯差異。鑒于在45℃氮吹條件下乙腈揮發速度較快，可縮短樣品的處理時間，同時經離心后萃取液澄清透明，提高了樣品的處理質量，故選用乙腈為提取劑。

3.2? 色譜條件的優化? 文獻報道流動相主要采用甲醇-四丁基溴化胺[12]、乙睛-四丁基溴化胺[13]、乙睛-甲醇-磷酸鹽[14]等。國標中以乙睛-磷酸溶液為流動相，采用熒光檢測器檢測，激發波長和發射波長分別為280nm和450nm[17]。通過全波長掃描在278nm處有最大吸收峰，流動相用三乙胺調pH值到3時，既可以有效將藥物與基質分離，同時能避免峰拖尾現象。通過對柱溫的篩選發現，在25～35℃范圍內，柱溫升高出峰時間略微提前，故確定柱溫為35℃。對流動相中乙睛比例優化試驗顯示，乙睛比例過小洗脫不徹底雜質峰出現，乙睛比例加大則出峰時間前移檢測時間縮短。在相同條件下，磷酸/三乙胺-乙腈比例為82：18（V/V）時分離效果最好。

在本試驗所建立的HPLC條件下，血漿中恩諾沙星及其代謝物環丙沙星含量測定的方法靈敏度、準確度和重現性均滿足檢測要求，適用于雞血漿中恩諾沙星和環丙沙星含量的測定。

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