菜心小孢子發育時期與花器官形態的相關性

龐強強 李德明 周曼 朱白婢 趙樞紐 蔡興來

摘 ?要??研究菜心小孢子不同發育時期的細胞學特征及其與花器官外部形態的相關性，為直接從花器官外部形態特征來判斷小孢子發育時期提供依據。結果表明，菜心小孢子發育分為四分體時期、單核期和雙核期，各時期特征明顯。菜心小孢子發育時期與花蕾和花藥外部形態特征密切相關，供試菜心材料中處在單核靠邊期的花蕾縱徑為3.05～?3.39?mm，花萼長為3.25～3.46?mm，花瓣長為2.10～2.33?mm，瓣萼比為0.63～0.71，花藥長為2.57～2.89?mm、瓣藥比為0.77～0.85，適合作為不同材料花蕾最佳取樣時期的鑒定指標。處在單核靠邊期的花器官外觀特征表現為花蕾飽滿，萼片綠色并包被著花冠，花瓣和花藥均為淺黃色，花藥略長于花瓣。可見，依據花器官形態特征可判斷菜心小孢子的發育時期及所對應的選蕾標準。

關鍵詞 ?菜心;小孢子;發育時期;花器官;形態特征中圖分類號??S634.5?????文獻標識碼??A

Correlation of Microspore Development Period and Flower Morphological Characteristics of Chinese Flowering Cabbage

PANG?Qiangqiang， LI?Deming， ZHOU Man， ZHU?Baibi， ZHAO?Shuniu， CAI?Xinglai^*

Vegetable Research Institute， Hainan Provincial Academy of Agricultural Sciences?/ Hainan Provincial Key Laboratory for Vegetable and Biology?/ Hainan Provincial Engineering Research Center for Melon and Vegetable Breeding， Haikou， Hainan?571100， China

Abstract ?The cytological characteristics of microspores in Chinese flowering cabbage?at different developmental periods were studied to reveal?the relationship between microspore development and buds morphology， which would provide evidences?for the culturing of anthers?and microspores. The results showed that the microspore developed in?tetrad， early-?or mid-uninucleate， late-uninucleate and binucleate?stages?obviously.?The microspore development showed correlativity with the morphological characteristics of buds and anthers. The buds 3.05–3.39?mm in height， the calyx 3.25–3.46?mm in length， the petal 2.10–2.33?mm in length， the ratio of flap?to calyx 0.63–0.71， the anther 2.57–2.89?mm in length， and the ratio of flap 0.77–0.85 were discovered to contain microspores at the late uninucleate.?These were?suitable for the identification of optimal sampling period of flower buds in different materials. At the late uninucleate stage， it?was?necessary that the anthers should be covered by the sepal， the anthers slightly longer than petals， and the flower bud was full， the petals and anthers showed pale yellow. Therefore， we can judge the development stage of Chinese flowering cabbage?microspore by morphological characteristics of flower organs so as to define the standard of bud selection in correspondence with the optimal stage of anthers culture.

Keywords ?Chinese flowering cabbage; microspore; developmental period; flowers organs; morphological characteristics

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.008

菜心（Brassica rapa syn.?Campestris ssp. Chinensis var. UtilisTsen et Lee）又名菜薹，為十字花科蕓薹屬一、二年生草本植物，由大白菜亞種和白菜亞種長期選擇和栽培馴化而來，原產我國南部，是我國華南地區的特產^[1]，生長周期短，在蔬菜周年供應尤其是淡季蔬菜供應上占有重要地位^[2]。菜心品質脆嫩、風味獨特，并伴有清熱解毒、殺菌、降血脂的功能^[3-4]， 因而具有“蔬品之冠”的美譽。菜心為異花授粉植物，雜種優勢明顯，但純合非常困難，利用一代雜種培育優良的自交系親本一般需6～8代，要對所選單株進行連續多代剝蕾自交純化，相當費工費時，且長期自交會出現自交衰退現象^[5-6]。應用游離小孢子培養技術獲得單倍體進而加倍成后代完全純合的雙單倍體植株（DH植株），可在較短時間內使材料得以純化，從而大幅度縮短育種年限，而游離小孢子培養體系的建立是關鍵所在^[7-8]。盡管小孢子培養技術已經取得了較大進展，但在實際操作中，小孢子培養受基因型^[9]、小孢子發育時期^[10]、供體植株所處的生理狀態^[11]、預處理^[12]、培養基^[13]等多種因素的影響，其中選擇適宜的小孢子發育時期是決定小孢子能否誘導成功的關鍵因子之一。就多數植物而言，單核靠邊期的小孢子最容易形成小孢子胚^[14-16]。通過細胞學觀察可確定小孢子的發育時期，但此方法需檢查每一個花藥，既費時費力，且會對小孢子活力造成一定的損傷。前人在辣椒^[17]、黃瓜^[18]、蘿卜^[19]、青花菜^[20]和甘藍^[21]等多種植物上的研究結果表明，小孢子發育時期與花蕾外部形態，如花蕾縱徑、花蕾橫徑、花藥長、花藥寬、花瓣長與花藥長比值等密切相關，但不同品種和變種以及不同的栽培條件，其形態指標有所不同。雖然菜心在花藥和小孢子培養方面已取得了很大進展，但是目前還存在著許多問題，導致出胚率和成苗率不高^[22-23]。為此，本研究擬通過觀察菜心小孢子各發育時期的細胞學特點，來探討其與花器官外部形態的相關性，以便能根據花器官形態來確定小孢子發育時期，為進一步開展菜心小孢子培養奠定基礎。

1??材料與方法

1.1材料

以海南省農業科學院蔬菜研究所葉菜組提供的5個菜心品種為供試材料，分別為C01（油青菜心，早熟）、C02（四-九月菜心，晚熟）、C03（尖葉菜心，中熟）、C04（油綠粗薹菜心，早熟）、C05（尖葉70?d，晚熟）。2018年2月下旬在海南省農業科學院永發試驗基地大棚內進行育苗，待幼苗長至5片真葉時定植于試驗田，常規栽培管理直至抽薹開花。于晴天上午8：00左右采摘健康且長勢較好的植株上的花蕾，取樣時主花序上的花蕾優先，其次為第一、第二分枝上的花蕾。

1.2方法

1.2.1??花蕾外部形態觀察??采用數顯游標卡尺測量菜心花蕾橫徑、花蕾縱徑、花萼長和花瓣長并記錄其形態特征，再將花萼、花瓣去除，取出花藥切除花絲后，分別測量花藥長度和花藥寬度，記錄花藥顏色。每個發育時期觀察并測量20個花蕾，重復3次。

1.2.2??小孢子不同發育階段的細胞學觀察??將各材料不同長度的花蕾（圖1）置于卡諾氏固定液（冰醋酸∶95%酒精為1∶3）中固定24?h后，轉移到70%酒精中，于0～4?℃冰箱中保存。制片時，用鑷子將花藥從固定的花蕾中取出置于載玻片上，并輕輕擠出花粉，用DAPI 熒光染液染色、壓片，制成臨時制片，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態結構，確定其所處的發育時期，每次觀察重復3次。

1.3數據處理

數據初處理采用Excel 2007軟件，差異顯著性分析采用Duncan法。

2??結果與分析

2.1菜心小孢子各發育階段的細胞學特征

菜心不同發育時期花蕾的顯微觀察結果見圖2。四分體時期，小孢子母細胞經過減數分裂后，形成由胼胝質包圍的4個細胞，經染色后有4個細胞核出現，此時小孢子的外部形態呈現為明顯的四裂狀（圖2A）;隨后，酶催化四分體胼胝質壁水解，釋放出的小孢子很快由不規則的外形輪廓變成圓形或近圓形，整個細胞體積較小，細胞核只有1個且處于細胞正中央，即單核中期（圖2B）;之后，小孢子體積逐漸增大，絨氈層細胞解體并為小孢子提供充足營養，中央大液泡開始形成，細胞核從中心被擠壓到靠近細胞壁，此時外形可見3 條較為明顯的萌發溝，形成花粉外壁，即為單核靠邊期（圖2C）;最后，單核花粉細胞繼續發育獲得充實后進行第1次有絲分裂，由于是不均等分裂，因此形成1個體積較大靠近液泡的營養細胞和1個體積較小貼近細胞壁的生殖細胞，2個核形狀均為圓球形（圖2D）;花粉粒再膨大，最終發育成外壁成熟花粉粒。

2.2菜心小孢子發育時期與花蕾形態特征的相關性

由表1可知，菜心小孢子發育時期與花蕾外部形態特征關系密切。同一菜心品種花蕾的各項形態指標，如花蕾縱徑、花蕾橫徑、花萼長、花瓣長均隨小孢子發育逐漸成熟呈顯著或極顯著增長的趨勢。處于同一發育時期的花蕾各項形態指標在不同菜心品種間也存在差異。四分體時期的小孢子花蕾縱徑為1.90～2.21?mm，花蕾橫徑為1.47～1.72?mm，花萼長為1.77～2.32?mm，花瓣長為0.63～0.76?mm，瓣萼比為0.33～0.41;花蕾縱徑為2.46～2.68 mm，花蕾橫徑為1.69～1.89?mm，花萼長為2.44～2.88?mm，花瓣長為1.26～1.46?mm，瓣萼比為0.44～0.58，此時的小孢子處于單核早中期;當花蕾縱徑為3.05～3.39?mm，花蕾橫徑為1.87～2.22?mm，花萼長為3.25～3.46?mm，花瓣長為2.10～2.35?mm，瓣萼比為0.63～0.71時，小孢子處于單核靠邊期;雙核期時花蕾的縱徑為3.62～3.88 mm，花蕾橫徑為2.31～2.49?mm，花萼長為3.75～4.21?mm，花瓣長為3.17～3.70?mm，瓣萼比為0.84～0.92。

2.3菜心小孢子發育時期與花藥形態特征的相關性

由表2可知，同一基因型不同發育時期的菜心小孢子，其花藥長、花藥寬、瓣藥比均存在顯著或極顯著差異;不同基因型同一發育時期花藥形態指標也存在差異。其中四分體時期的花藥長為1.51～1.82 mm，花藥寬為0.52～0.63?mm，瓣藥比為0.41～0.44;單核早中期的花藥長為2.08～?2.46?mm，花藥寬為0.61～0.83?mm，瓣藥比為0.51～0.68;單核靠邊期花藥長為2.57～2.89?mm，花藥寬為0.82～1.01?mm，瓣藥比為0.77～0.85;雙核期的花藥長為3.04～3.48?mm，花藥寬為0.97～1.07?mm，瓣藥比為1.00～1.22。

2.4菜心小孢子發育時期與花蕾和花藥外部形態變化的關系

由表3可知，隨著小孢子發育時期的變化，不同基因型菜心的花蕾和花藥外部形態也發生變化。適宜取材的單核靠邊期的花蕾膨大較明顯，花冠被萼片緊密包裹，花藥較花瓣略長，花瓣和花藥均為淺黃色。

3??討論

植物小孢子發育可分為四分體時期、小孢子時期和成熟花粉粒時期，其中小孢子時期又包括單核早期、單核中期、單核靠邊期和雙核期。對于小孢子培養而言，并非任何發育時期的小孢子都適合。花蕾發育時期過早，小孢子尚未形成，此時受外界環境影響較大，幾乎不能培養成胚^[24];選取發育過晚的小孢子由于其因為失去脫分化能力，導致小孢子發育進程中斷^[25]。由此可見，小孢子發育時期對于小孢子培養成功與否起著決定性的作用。不同作物的小孢子最適培養時期不同，同一作物不同研究者得到的結果也有不同。Takahata等^[26]在研究甘藍時發現，甘藍小孢子培養的最佳時期是單核靠邊期至雙核期。詹艷等^[16]研究發現，單核靠邊期是進行黃瓜游離小孢子培養的最佳時期，謝淼等^[27]研究發現，處于單核中后期的黃瓜小孢子易于誘導出胚。袁素霞等^[28]選取單核靠邊期的結球甘藍和青花菜花蕾進行游離小孢子培養，成功獲得了約7000份小孢子再生植株。

本研究發現菜心小孢子發育過程不僅可劃分為不同階段，而且小孢子發育階段與花器官各形態指標關系密切，因此可以根據花蕾形態、大小和花藥發育情況來判斷菜心小孢子的發育時期。在十字花科蔬菜上的研究表明，處于單核靠邊期的小孢子易于誘導出胚狀體^[29-31]。通過觀察5份菜心材料小孢子發育不同時期的花蕾和花藥形態特征發現，不同菜心材料的小孢子處于單核靠邊期的花蕾表現為花蕾飽滿，萼片綠色并包被著花冠，花瓣和花藥均為淺黃色，花藥略長于花瓣，即花蕾縱徑為3.05～3.39?mm，橫徑為1.97～?2.22?mm，花萼長為3.25～3.46?mm，花瓣長為2.10～2.33?mm，瓣萼比為0.63～0.71，花藥長為2.57～2.89?mm，花藥寬為0.84～1.01?mm，瓣藥比為0.77～0.85，此時就單個品種來說，這些指標均可作為確定小孢子發育適期花器官特征的參考。通過比較不同菜心材料花器官在單核靠邊期的各項指標發現，花蕾橫徑和花藥寬在不同基因型之間差異均較大，不易找到統一標準來確定最適花蕾大小，如C02單核靠邊期的花蕾橫徑為1.87?mm，與C04單核早中期的1.89?mm接近。對于所有供試材料來說，單核靠邊期的花蕾縱徑、花萼長、花瓣長、瓣萼比、花藥長和瓣藥比與其他發育時期的同類指標相比不存在尺度上的重疊，因此它們更適合作為不同材料最適取樣時期的鑒定指標，這與前人在菜心上的報道也較為類似。如朱允華^[32]在菜心花藥和花粉培養中發現，當花瓣達到花藥長度的1/2～4/5、花藥淺黃色、花蕾長為2.5～3.5?mm時，大多數的小孢子處于單核靠邊期。吳藝飛等^[33]用瓣萼比在0.626～0.834的花蕾成功進行了紅菜薹小孢子培養。比較而言，前人在菜心等作物的小孢子培養研究中不曾采用瓣萼比這一指標，本文豐富了菜心小孢子培養的研究結果。在實際應用中，如果菜心小孢子最佳培養時期以單核靠邊期為準，則可依據本研究結果來判斷，以此實現在田間直接取材而不需要鏡檢，這對菜心小孢子培養具有重要意義。然而在進行菜心小孢子培養時，除上述影響因素外，還要考慮供體植株的基因型、生長環境、培養基、預處理等因素對培養效率的影響。

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