細胞壁蔗糖轉化酶活性上調對番茄果實和種子生長發育的不同影響

辛曙麗 郭德勝 賴涵旸 劉永華

摘 ?要??以T4代的轉基因番茄為材料，研究細胞壁蔗糖轉化酶（CWIN）活性上調對番茄果實和種子發育的不同影響。結果發現，CWIN活性上調增加了單果鮮重，但單果種子數量、發芽勢和發芽率顯著下降，表明CWIN在促進番茄果實生長發育的同時，抑制了種子的生長發育。進一步的生理生化指標測定表明，造成上述現象的可能原因有2個：①CWIN活性上調導致果實中儲存的淀粉含量下降，同時己糖（葡萄糖和果糖）含量顯著上升，表明轉基因果實利用過剩光合產物所積累的淀粉的能力增強，從而可以利用的糖分增加，但這些糖分主要被用于果實的生長發育和果實己糖的積累，而不是用于種子生長發育。②CWIN活性上調還導致果實中的葉綠素含量下降，推測這可能會導致果實的光合作用下降，從而造成種子生長發育得不到充足的糖分供應，因而生長發育受到抑制。總之，CWIN活性上調可抑制種子發育和促進果實發育，這將為進一步提高番茄的產量和品質提供一種新的思路和方法。

關鍵詞 ?番茄;細胞壁轉化酶;蔗糖代謝;果實;種子中圖分類號??S641.2??????文獻標識碼??A

Differential?Effects of Up-regulation of Cell Wall Invertase Activity on Fruit and Seed Development in Tomato

XIN Shuli²， GUO Desheng¹， LAI Hanyang¹， LIU Yonghua^1*

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Administration?Bureau of Agricultural Technology?of Lingshui， Lingshui， Hainan 572400， China

Abstract ?The T4 transgenic tomato with elevated CWIN activity was employed to study the effects of CWIN on seed and fruit development. It was found that the elevated CWIN activity resulted in increased?fresh weight per fruit， but decreased seed number per fruit， seed germination rate and germinability. These results showed that although the development?of fruit was enhanced by the elevated CWIN activity， the development of seed was impaired. Further investigations at physiological level revealed two possible reasons for the above-stated phenomenon： ①The elevation of CWIN activity led to decreased starch content and increased?hexose （i.e. glucose and fructose） content， indicating there was enhanced capability of transgenic fruits in utilizing photo-assimilates， which facilitating the development of fruit and the hexose accumulation in fruit， instead?of the development of seed. ②The elevation of CWIN activity also resulted in decreased content of chlorophyll in fruits， implying decreased photosynthetic activity of fruit and thus inhibiting seed development due to inadequate supply of photo-assimilates to seed from fruit photosynthesis. Altogether， the elevation of CWIN activity inhibited the development of seed， but promoted that of fruit， which could provide a new pathway to increase the yield and quality of tomato.

Keywords ?tomato; cell wall invertase; sucrose metabolism; fruit; seed

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.009

蔗糖分解代謝在種子和果實發育中發揮著重要的作用，是決定種子和果實產量與品質的重要因素^[1-2]。蔗糖及其分解產生的己糖（葡萄糖和果糖）不僅為果實和種子的發育提供碳骨架和能量，而且也作為信號分子通過調控不同基因的表達從而影響果實和種子的生長發育進程。

植物體內有2種分解蔗糖的酶：蔗糖合成酶（sucrose synthase，Sus）和蔗糖轉化酶（sucrose invertase，INV）。其中Sus將蔗糖分解為UDP-葡萄糖和果糖，而INV將蔗糖水解為葡萄糖和果糖^[3]。根據亞細胞定位的不同，INV可進一步劃分為3類：細胞壁轉化酶（cell wall invertase，CWIN）、液泡轉化酶（vacuolar invertase，VIN）和細胞質轉化酶（cytoplasmic invertase，CIN）^[4]。研究表明，CWIN是影響種子和果實發育的重要蔗糖分解酶之一。例如，玉米胚乳中CWIN基因的突變導致其活性下降以后，胚乳中的細胞分裂和膨大受到抑制，表現為種子皺縮變小^[5-6]。水稻中的CWIN基因GIF1是控制種子灌漿過程的關鍵基因，GIF1的突變導致種子變小、堊白增加，產量和品質均出現下降^[7]。通過RNA干擾技術抑制番茄果實中主要CWIN基因Lin5的表達導致落花落果率增加，果實產量下降^[8]。CWIN抑制因子是一種小分子蛋白質，可以和CWIN蛋白結合從而降低CWIN的活性。通過減少CWIN抑制因子表達的方式來增加CWIN的活性則可增加番茄在熱脅迫下的座果率和產量^[9]。然而，前人的研究僅僅孤立地關注CWIN活性變化對果實或種子生長發育的影響，很少同時關注果實和種子的生長發育，特別是兩者的均衡發育和相互影響的問題。

果實和種子的發育之間存在著復雜的相互作用。一方面，種子可提供果實生長發育所需的激素，而果實將種子包裹起來，為其種子生長發育提供保護和養分^[10]。另一方面，在果實和種子這2個器官之間還存在顯著的養分競爭關系。例如，對菜豆豆莢發育的研究表明，在豆莢發育初期，莢壁（果實）與種子對蔗糖的吸收利用存在顯著的競爭關系，只是到了豆莢發育的后期，莢壁中的養分才重新進行分配進入種子，促進種子的生長^[11]。在羽扇豆莢壁和種子的發育中也觀察到類似的養分競爭關系，對35個羽扇豆品種的研究表明，莢壁在豆莢中所占的比重越大，則最終種子的產量越低，即莢壁和種子生長量之間呈顯著負相關^[12]。因此，在全球糧食產量增長已達到平臺期很難進一步提升的大背景下，對種子或果實生長發育進行有目的的調控有望進一步提高全球糧食產量。

本研究以番茄為模式植物，通過RNA干擾技術（RNAi）降低CWIN抑制因子的表達來提高CWIN的活性，然后研究其對番茄果實和種子生長發育的不同影響及其相關作用機理，從而為進一步提高糧食產量提供新的思路和理論依據。

1 ?材料與方法

1.1材料

實驗材料為新疆農業科學院園藝研究所育成的番茄品種‘新番2號，Jin等^[13]利用RNA干擾技術下調該番茄中CWIN抑制因子的表達，從而提高了植株中的CWIN活性。2017年3月28日將T4代轉基因種子播種于海口市海南大學實驗基地溫室內。5月10日定植于栽培盆內（盆高35?cm，上口徑29?cm），每盆1株番茄，野生型和轉基因植株各8盆。盆中的基質配比為土∶椰糠∶腐熟羊糞=1∶1∶2，并混合適量復合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）。6月8號開始進行開花掛牌，以記錄和確認每個果實的發育時期。

1.2 方法

1.2.1 ?番茄果實相關指標的測定??‘新番2號屬于有限生長型的早熟番茄品種，植株在結3串果后封頂，果實在花后40?d左右基本達到成熟期。記錄每株番茄成熟果實的單果鮮重和單株果實鮮重。

1.2.2 ?番茄種子相關指標的測定??番茄果實達到紅熟期后進行采摘，經過7?d后熟后將種子從果實中取出、洗凈并晾干，分別測定單個果實中種子的數量、種子千粒重。

種子發芽率和發芽勢的測定：將單株番茄上的種子混合，隨機選取100粒種子進行發芽實驗。首先將種子在70%酒精中浸泡、振蕩1?min，然后在稀釋40倍的8%次氯酸鈉溶液中浸泡5?min。把消過毒的種子放于培養皿中，在恒溫28?℃的條件下進行催芽，記錄第3天發芽的種子數并計算其發芽勢，以第7天的發芽數計算其最終的發芽率。

1.2.3 ?番茄果實中CWIN活性、可溶性糖和淀粉含量的測定??本研究取花后25 d的果實用于CWIN活性的測定，具體參照Tomlinson等^[14]的方法。取花后10、25和40 d的番茄果實進行CWIN酶可溶性糖和淀粉含量的測定（均以鮮重計）。蔗糖、葡萄糖、果糖含量測定參照King等^[15]的酶學方法。淀粉含量的測定參考Smith等^[16]的酶學測定方法。

1.2.4 ?葉綠素含量的測定??參考李蒙等^[17]的方法，采用乙醇、丙酮、水混合液浸提葉綠素，然后利用分光光度計測定花后25 d番茄果實中的葉綠素含量，以鮮重計。

1.3 數據處理

利用Excel 2003軟件對數據進行t-test分析。

2??結果與分析

2.1 CWIN活性上調對果實數量和大小的影響

果實的數量和大小共同決定番茄的最終產量，因此首先測定了CWIN活性上調對番茄花后40 d果實數量和大小的影響。結果發現，轉基因番茄（RNAi）和野生型番茄（WT）雖然在單株果實數量上沒有顯著差異（圖1A），但轉基因番茄單個果實的鮮重顯著高于野生型番茄（圖1B）。花后25 d果實中CWIN活性的測定結果表明，轉基因果實的CWIN活性顯著高于野生型果實（圖1C）。上述證據表明，CWIN活性的上調促進了番茄果實的生長發育。

2.2 CWIN活性上調對番茄果實可溶性糖和淀粉含量的影響

本研究所采用的番茄‘新番2號屬于早熟品種，果實在花后40?d已達到紅熟期。花后10、25和40 d果實可溶性糖的測定結果表明，轉基因（RNAi）果實的葡萄糖和果糖含量顯著高于野生型（WT），但兩者在蔗糖含量方面沒有顯著差異（圖2A～圖2C）。此外，果實中的葡萄糖和果糖含量遠遠高于蔗糖含量。

淀粉含量的測定結果表明，隨著生長發育的進行，轉基因和野生型果實中的淀粉含量均呈現下降的趨勢（圖2D）。值得注意的是，轉基因番茄的淀粉含量在各個發育時期始終顯著高于野生型番茄。

2.3 CWIN活性上調對番茄種子生長發育的影響

上述結果表明，CWIN活性上調增加了單果鮮重。由于果實和種子的生長發育之間存在著競爭關系，因此對番茄種子的生長發育也進行了研究。結果發現，雖然轉基因番茄種子的千粒重沒有發生顯著變化（圖3A），但是轉基因番茄單個果實中的種子數量下降了32%，顯著低于野生型（圖3B）。種子發芽實驗進一步表明，轉基因番茄種子的發芽率（發芽7 d后）顯著降低，僅為野生型的57%（圖3C）。此外，發芽勢（發芽3 d后）受到的影響更為明顯，轉基因番茄僅為野生型的46%（圖3D）。上述證據表明，CWIN活性上調不僅導致果實中種子的數量下降，同時種子質量也顯著下降。

2.4?CWIN活性上調對果實葉綠素含量的影響

本研究所使用的T4代轉基因番茄植株和野生型植株在開花結果之前很難從外觀上進行區分，但開花結果后發現轉基因番茄果實的顏色變淡（圖4A），表明果實中的葉綠素含量可能出現下降。花后25 d果實葉綠素含量的測定結果表明，轉基因果實中的總葉綠素含量確實顯著降低，僅為野生型的62%（圖4B）。由于番茄果實中葉綠素及其光合產物主要用于種子的生長發育^[18]，因此推測CWIN活性上調所導致的果實葉綠素含量下降可能是造成轉基因番茄種子生長發育受到抑制的原因之一。

3 討論

研究表明，高活性的CWIN可促進種子或果實的生長發育。例如，通過突變或轉基因手段降低玉米、水稻或番茄中的CWIN活性導致其種子或果實的產量降低^[5-8]。相反，通過轉基因手段增加CWIN的活性則可增加番茄在熱脅迫下的座果率和產量^[9]。然而，前人在研究CWIN在果實或種子發育中的作用時，大多對種子或果實單獨進行研究，很少對兩者同時進行研究。通過同時研究CWIN對種子和果實發育的影響，有助于闡明果實和種子發育之間的互作和發育平衡問題，為將來定向提高種子或果實產量和品質提供理論依據。

本文同時研究了CWIN活性上調對番茄果實和種子生長發育的影響。結果發現，通過轉基因手段提高番茄的CWIN活性后，單果鮮重顯著增加，同時果實中的葡萄糖和果糖含量上升。但進一步對種子的研究表明，CWIN活性上升導致單個果實中的種子數量下降，同時種子的發芽勢和發芽率也顯著下降。這表明CWIN活性上調在促進果實生長發育的同時，也抑制了種子的生長發育。因此，番茄果實和種子生長發育之間也存在競爭和相互抑制的關系，這和在豆類上的研究結果相似^{[12， 19]}。

特別值得注意的是，轉基因番茄在單果種子數量出現下降的情況下，不但單株果實數量沒有下降，單果鮮重和果實己糖含量反而上升。因此本研究表明，可以通過對蔗糖分解代謝的調控來促進果實發育并抑制種子發育，從而實現提高番茄果實產量和品質的最終目的。

CWIN活性上調促進果實生長發育、但抑制種子生長發育的可能原因有2個。首先，來自葉片的光合產物主要被用于果實的生長，而不是種子的生長。其次，高活性的CWIN可通過加速分解蔗糖來降低種子或果實中的蔗糖濃度，從而促進蔗糖從光合葉片向種子/果實的轉運，為種子或果實發育提供更多的能量和碳骨架^{[3， 7]}。例如，Liu等^[9]使用本研究中的轉基因番茄為研究材料，發現CWIN活性上調可顯著增加熱脅迫下蔗糖向花后2 d果實的轉運速率，從而提高了番茄在熱脅迫下的座果率。本研究發現，在轉基因果實鮮重增加和葡萄糖、果糖含量上升的情況下，其蔗糖含量并沒有下降，這表明CWIN活性上調可能提高了蔗糖向果實的轉運速率和果實中蔗糖的分解速率。

除上述來源外，轉基因果實中高濃度的己糖（特別是葡萄糖）也可能來自淀粉的分解。植物白天可以把多余的光合產物以淀粉的形式儲存起來供光合效率低的時候或晚上使用^[3]。轉基因番茄果實的淀粉含量在整個發育時期都顯著低于野生型番茄，這表明轉基因果實在分解利用淀粉方面的能力要強于野生型果實。但無論這些己糖是來自于蔗糖的分解還是淀粉的分解，轉基因果實可以利用的己糖要多于野生型。然而，基于本研究結果，轉基因果實和種子利用己糖的能力可能并不相同，即這些己糖主要是用于果實生長（或儲存于果實中），而不是用于種子的生長發育。

其次，果實葉綠素含量下降可能導致種子發育得不到充足的糖分供應。前人的研究表明，番茄果實中葉綠素及其光合產物主要用于種子的生長發育，特別是在脅迫情況下。例如，在專一性抑制果實中谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶（GSA）的表達后，番茄果實的葉綠素含量和光合速率出現下降，這導致種子早期發育進程受到不利影響，但對果實發育沒有任何影響^[18]。本研究表明，CWIN活性上調導致果實中的葉綠素含量下降，這可能會導致果實光合作用下降，從而導致種子得不到充足的糖分供應，最終阻礙種子的生長發育。

需要指出的是，本研究發現CWIN活性上調對番茄種子千粒重沒有顯著影響，而Jin等^[13]發現CWIN活性上調導致種子單粒重增加22%。2個研究使用同一轉基因材料，而研究結果卻不相同，這可能是因為本研究中所使用的轉基因番茄為T4代，而Jin等^[13]使用的是T2代植株。經過多代繁殖后，T4代植株可能在表觀遺傳水平上發生了某些變化，因而導致不同的研究結果，但需要進一步的研究來驗證該假設。

參考文獻

• Weber H， Borisjuk L， Wobus U. Molecular physiology of legume seed development[J]. Annual Review of Plant Biology， 2005， 56： 253-279.
• Ruan Y?L.?Signalling role of sucrose metabolism in development[J]. Molecular Plant， 2012，?5（4）： 763-765.
• Ruan Y L. Sucrose metabolism： gateway to diverse carbon use and sugar signaling[J]. Annual Review of Plant Biology， 2014， 65： 33-67.
• Sturm A. Invertases，?primary structures， functions， and roles in plant development and sucrose partitioning[J]. Plant Physiology， 1999， 121（1）： 1-8.
• Miller M?E， Chourey P?S.?The maize invertase-deficient minature-1 seed mutation is associated with aberrant pedicel and endosperm development[J]. Plant Cell， 1992，?4：?297-305.
• Vilhar B， Kladnik A， Blejec A， et al. Cytometrical evidence that the loss of seed weight in the miniature1 seed mutant of maize is associated with reduced mitotic activity in the developing endosperm[J]. Plant Physiology， 2002，?129： 23-30.
• Wang E， Wang J， Zhu X， et al.?Control of rice grain-filling and yield by a gene with a potential signature of domestication[J]. Nature Genetics， 2008，?40： 1370-1374.
• Zanor M?I， Osorio S， Nunes-Nesi A， et al. RNA interference of LIN5 in Solanum lycopersicum?confirms its role in controlling Brix content， uncovers the influence of sugars on the levels of fruit hormones and demonstrates the importance of sucrose cleavage for normal fruit development and fertility[J]. Plant Physiology，?2009， 150： 1204-1218.
• Liu Y?H， Offler C?E， Ruan Y?L. Cell wall invertase promotes fruit set under heat stress by suppressing ROS-independent plant cell death[J].?Plant Physiology， 2016， 172：?163-180.
• Eeuwens C?J， Schwabe W?W.?Seed and pod wall development in Pisum sativum?L. in relation to extracted and applied hormones[J]. Journal of Experimental Botany，?1975， 26： 1-14.
• Oliker M， Poljakoff-Mayber A， Mayer A?M.?Changes in weight， nitrogen accumulation， respiration and photosynthesis during growth and development of seeds and pods of Phaseolus vulgaris[J]. American Journal of Botany， 1978， 65：?366-371.
• Lagunes-Espinoza L?C， Huyghe C， Papineau J， et al.?Effect of genotype and environment on pod wall proportion in white lupin： consequences to seed yield[J]. Australian Journal of Agricultural Research， 1999， 50： 575-582.
• Jin Y， Ni D?A， Ruan Y?L. Posttranslational elevation of cell wall invertase activity by silencing its inhibitor in tomato delays leaf senescence and increases seed weight and fruit hexose level[J]. Plant Cell， 2009，?21： 2072-2089.

[14]?Tomlinson K?L， McHugh S， Labbe H，et al.Evidence that the hexose-to-Suc ratio does not control the switch to storage product accumulation in oilseeds： analysis of tobacco seed development and effects of overexpressing apoplastic invertase[J]. Journal of Experimental?Botany， 2004， 55： 2291-2303.

[15]?King S?P， Lunn J?E， Furbank R?T.?Carbohydrate content and enzyme metabolism in developing canola （Brassica napusL.） siliques[J]. Plant Physiology， 1997， 114： 153-160.

[16]?Smith A?M， Zeeman S?C.?Quantification of starch in plant tissues[J]. Nature?Protocols， 2006，?1： 1342-1345.

[17]?李 ?蒙， 束 ?勝， 郭世榮， 等. 2，4-表油菜素內酯對櫻桃番茄光合特性和果實品質的影響[J]. 西北植物學報， 2015， 35（1）： 138-145.

[18]?Lytovchenko A， Eickmeier I， Pons C，et al. Tomato fruit photosynthesis is seemingly unimportant in primary metabolism and ripening but plays a considerable role in seed development[J]. Plant Physiology， 2011， 157（4）：?1650-1663.

[19]?Huyghe C， Ney B. Architecture effects on yield and produce quality[C]//Problems and Prospects for Winter Sowing of Grain Legumes in Europe. Dijon： Proc AEP workshop， 1997： ?77-82.