皇后帝王花種皮特性對種子休眠的影響

山金鳳 劉子嘉 曾瑩 陳軍 吳向崇 祝遵凌

摘 ?要??以皇后帝王花種子為實驗材料，對其進行形態解剖、種皮超微結構觀測、種皮透水性與含水量檢測，以了解皇后帝王花種皮結構與種子休眠的關系。結果表明：①皇后帝王花種子的種皮分為3層，外種皮的柵欄結構增強了種子的不透性，高度木質化的中種皮使種子堅硬，內種皮較薄卻被一層不易透水的蠟質包裹;②酸蝕處理能使皇后帝王花種子種皮表面結構疏松，種皮變薄，種孔露出。但酸蝕4?h種子的中種皮及內種皮已經出現破壞性開裂，嚴重影響到胚活力;③完整干種子與酸蝕0.5?h種子在前14?h均能快速吸水，吸水50?h后近飽和狀態，自此，二者吸水率小范圍波動直至完全飽和;④酸蝕處理種子并不能使胚更好的吸水保水。因此，皇后帝王花種皮結構對胚的吸水并未形成阻礙，但不能排除其對胚呼吸的影響及對胚根的伸長和生長產生機械阻力的可能。

關鍵詞 ?皇后帝王花;種皮結構;透水性;種子休眠中圖分類號??S682.39?????文獻標識碼??A

The Seed Coat Structure of Protea magnifica?andIts Effects on Seed Dormancy

SHAN Jinfeng^1，2，?LIU Zijia⁴，?ZENG Ying^1，2，?CHEN Jun¹，?WU Xiangchong⁴，?ZHU Zunling^1，2，3*

1. Co-innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing， Jiangsu 210037， China; 2.?College of Landscape Architecture， Nanjing Forestry University， Nanjing， Jiangsu 210037， China; 3. College of Arts & Design， Nanjing Forestry University， Nanjing， Jiangsu 210037， China; 4. Sanya Daxing New Landscape Ecological Co. Ltd， Sanya， Hainan 572022， China

Abstract ?In order to discuss the seed dormancy characteristics ofProtea magnifica，?the seed morphology anatomical structure，?seed coat ultrastructure?and water permeability?were observed. The?results showed?that： ①The seed coat ofP.?magnifica consisted?of three layers， the fence structure of the external seed coat enhancing?the impermeability of the seeds， the highly lignified middle seed coat protecting the seeds， the thin inner seed coat covered with a layer of water-impervious wax. ②The acid etching treatment could make the seed coat?loose， the seed coat thin， and the seed hole exposed.?However， the middle seed coat and inner seed coat etched had already undergone destructive cracking?after the 4-hours treatment， which seriously affected the vitality of the embryos.?③The dry seeds and seeds?etched for 0.5?h?could?absorb water quickly in the first 14?h treatment，?and nearly saturated after 50 h treatment. Since then， the two water absorption rates fluctuated?in a small range until they?were?fully saturated. ④The seed treated by acid etching did?not allow the embryo to absorb water， therefore，?the seed coat structure ofP.?magnifica did?not hinder the water absorption of the embryo， but?it couldnt be ruled out the the effect on embryo respiration and the possibility of mechanical resistance to radicle elongation and growth.

Keywords ?Protea magnifica; structure of seed coat; water permeability; seed dormancy

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.010

皇后帝王花（Protea magnifica）為山龍眼科帝王花屬（又名帕洛帝屬）多年生常綠灌木，其花朵巨大、色彩美麗、花期持久，是國際切花市場廣受歡迎的高檔木本切花^[1-2]。原產南非開普敦地區^[3]，一些用于切花生產的帝王花品種已從南非擴展到世界其他地區，如澳大利亞、加利福尼亞、新西蘭等^[4]，我國云南地區在近些年對山龍眼科多種切花品種進行了引種研究^[5-10]。然而帝王花屬植物的引種成本高，國際運輸時間久，并且傳統方法出苗率極低^[10]，這給該屬植物的引種、擴繁和推廣帶來了許多困難。目前，國內帝王花輸出僅依靠我國云南部分地區，短期內仍難以擺脫對國外進口的依賴。

影響種子休眠的因素較為復雜，除去種子的種皮結構外，種胚是否發育完全、是否存在生理后熟，種皮及胚是否含有發芽抑制物^[11]等都是影響種子萌發的原因。本研究通過對皇后帝王花種子的外部形態、種皮超微結構、種皮透水性與含水量等方面探索皇后帝王花種子休眠原因及皇后帝王花種子生理學研究，為今后探討皇后帝王花種子休眠機理及實生種苗繁殖提供理論依據。

1??材料與方法

1.1 材料

以2017年12月由哥斯達黎加引進的皇后帝王花（Protea magnifica）種子為實驗材料，去除癟粒、腐壞的種粒及雜質，取新鮮飽滿的帝王花種子備用。

1.2方法

1.2.1 ?種子基本形態觀測??外部形態：記錄皇后帝王花種子的形狀、顏色、表面紋理等特征。

種子大小：四分法隨機選取供試皇后帝王花種子300粒，用游標卡尺測量種子長度及寬度，以平均值作為種子大小。

千粒質量：四分法隨機選取8組各100粒的供試皇后帝王花種子，1/10?000電子分析天平稱重，以8組數據的平均值表示皇后帝王花種子的千粒質量。

內部構造：隨機選取10粒供試皇后帝王花種子，在清水中浸泡24?h使其膨脹和軟化，去掉外部種皮，分離出胚，并將種子縱切以觀察內部結構。

1.2.2 ?種子超微結構觀察??取未經處理的皇后帝王花帶殼種子、去殼種子（帶內種皮的胚、胚）以及酸蝕帶殼種子（98%濃硫酸處理0.5、2、3、4 h，流水沖洗24 h后晾干）粘貼在載物臺上，經離子濺射儀噴金鍍膜后在FEI Quanta200環境掃描電子顯微鏡下觀察種子整體、表面、種孔處及縱斷面結構，記錄并拍照后用Image J測量種皮厚度。

1.2.3 ?種皮透水性測定??取50粒未處理的完整干種子，50粒酸蝕種子（98% H₂SO₄處理0.5?h后流水沖洗24 h），設3組重復，對這6組種子稱重并記錄質量后，將種子分別放入燒杯再加入60?mL蒸餾水，置于25?℃的人工智能氣候箱中進行吸水實驗。定期（第1天日間隔2?h，之后日間隔6?h，夜間隔12?h）將種子取出，吸去種子外部水分，用1/10 000電子分析天平稱質量并記錄，如此反復，直至種子吸水飽和。吸水率=（吸水后質量–吸水前質量）/吸水前質量×100%。

1.2.4 ?種子各部分含水量測定??在種皮透水性測定結束后，將飽和狀態的皇后帝王花種子剝離為種皮和胚兩部分，并以未處理的完整干種子為對照，將其種皮與胚分別放入鋁盒中，采用恒高溫烘干法測定并計算種子各部分含水量，以了解在吸水實驗中皇后帝王花種皮和胚的吸水能力以及種皮是否阻礙了胚的吸水。

含水量= （m₂–m₃）/（m₂–m₁）×100%

式中，m₁為鋁盒質量（g）;m₂為鋁盒及樣品的烘前質量（g）;m₃為鋁盒及樣品的烘后質量（g）。

1.3數據處理

所得數據采用Excel 2010軟件處理，用SPSS 24.0軟件分析差異顯著性，用Origin 2017軟件作圖。

2??結果與分析

2.1皇后帝王花種子基本形態

皇后帝王花種子為瘦果，種子長（1.29±0.11）?cm，寬（0.75±0.08）?cm，千粒質量（199.36±0.23）?g。整體輪廓呈卵圓形近圓形，種殼木質，較硬，呈褐黃色或淡黃色，表面具隆起的縱條紋和明顯的棱，種脊明顯。外種皮有局部開裂脫落（圖1A），基部微尖且周圍密生棕黃色短絨毛（圖1B），內有種孔。種仁近圓形（圖1C），內種皮薄且與胚緊密貼合，去除內種皮后的胚呈乳白色（圖1D），兩片子葉飽滿。

2.2皇后帝王花種皮超微結構

電鏡觀察未經處理的皇后帝王花種子表面，其種皮紋飾清晰，外種皮局部縱裂且有細小裂痕（圖2A1），放大200倍，種子表面角質化，凹凸不平（圖2A2）;觀察種子縱斷面（圖2A3），其種皮分為3層，外種皮厚度約為269.42?μm，中種皮厚度約為584.34?μm，內種皮厚度約為81.92?μm，外種皮與中種皮貼合緊密，中種皮與內種皮易剝離。外種皮由角質化的表皮細胞，細胞壁強烈增厚的單層柵欄細胞連接而成，其中柵欄細胞厚度約為46.23?μm（圖2F1），其結構致密，存在阻礙氣體和水分自由擴散的可能;中種皮約占種皮厚度的3/5，細胞高度木質化且排列緊密，靠近內種皮處由多層薄壁細胞排列而成（圖2F2）;內種皮較薄，由難透水的蠟質形成一層保護膜（圖2F3）;種子頂部殘存的扁平花柱處細胞呈長橢圓狀，大小不一（圖2F4）。

濃硫酸處理0.5?h后，種子角質層受損，表面出現許多微孔（圖2B1，圖2B2），外種皮已被腐蝕，此時中種皮厚度約為487.731?μm，與酸蝕前種子相比種皮明顯變薄（圖2B3），并且，種孔周圍絨毛和種皮被濃硫酸腐蝕（圖2B4）;濃硫酸處理2?h后，種子表面的小孔相互連接形成不同大小的腐蝕坑，坑內有針眼狀小孔出現（圖2C1，圖2C2），中種皮更薄（圖2C3），種孔處種皮結構疏松，出現平行于種皮的裂痕（圖2C4）;濃硫酸處理3 h后，種子表面布滿腐蝕坑（圖2D1），部分腐蝕坑形成更深的洞（圖2D2），這些坑洞的產生可以很好地增強種子的透性，中種皮進一步變薄（圖2D3），種孔處支離破碎，種皮比種子其他部位更薄（圖2D4）;濃硫酸處理4 h后，種子一側的內種皮部分外露（圖2E1），種皮表面的裂痕加深，結構更加疏松（圖2E2），中種皮厚度約430.66?μm（圖2E3），種孔附近部分種皮已被腐蝕，濃硫酸進入內部，傷及胚（圖2E4）。

由此可見，酸蝕處理可以有效地破壞皇后帝王花種子堅硬的種皮結構，減小種皮的機械障礙，改善種皮的透水透氣性，但很容易酸蝕過頭而傷及胚。所以在對皇后帝王花種子酸蝕處理時，需注意根據種子種皮厚度、堅硬度以及干燥程度確定最佳酸蝕時間，使種皮變薄種孔明顯而不至于傷及胚。

A1、A2：未處理種子種皮表面結構（50×，200×）;A3：未處理種子種皮縱斷面結構（80×）;A4：未處理種子種孔部位（40×）。B1、B2：酸蝕0.5 h種子種皮表面結構（50×，200×）;B3：酸蝕0.5 h種子種皮縱斷面結構（80×）;B4：酸蝕0.5 h種子種孔部位（40×）。C1、C2：酸蝕2 h種子種皮表面結構（50×，200×）;C3：酸蝕2 h種子種皮縱斷面結構（80×）;C4：酸蝕2 h種子種孔部位（40×）。D1、D2：酸蝕3 h種子種皮表面結構（50×，200×）;D3：酸蝕3 h種子種皮縱斷面結構（80×）;D4：酸蝕3 h種子種孔部位（40×）。E1、E2：酸蝕4 h種子種皮表面結構（50×，200×）;E3：酸蝕4 h種子種皮縱斷面結構（80×）;E4：酸蝕4 h種子種孔部位（40×）。F1、F2、F3、F4：未處理種子外種皮縱斷面結構（300×），中種皮縱斷面結構（600×），內種皮縱斷面結構（1200×），種子頂端縱斷面結構（160×）。

A1， A2： Seed coat structure of untreated seeds （50×， 200×）; A3： Longitudinal profile of untreated seeds （80×）; A4： Seed hole of untreated seeds （40×）. B1， B2： Seed coat structure of acid-etched 0.5 hours seeds （50×， 200×）; B3： Longitudinal profile of acid-etched 0.5?hours seeds?（80×）; B4： Seed hole of acid-etched 0.5?hours seeds （40×）. C1， C2： Seed coat structure of acid-etched 2 hours seeds （50×， 200×）; C3： Longitudinal profile of acid-etched 2 hours seeds （80×）; C4： Seed hole of acid-etched 2 hours seeds （40×）. D1， D2： Seed coat structure of acid-etched 3 hours seeds （50×， 200×）; D3： Longitudinal profile of acid-etched 3 hours seeds （80×）; D4： Seed hole of acid-etched 3 hours seeds （40×）. E1， E2： Seed coat structure of acid-etched 4 hours seeds （50×， 200×）; E3： Longitudinal profile of acid-etched 4 hours seeds （80×）; E4： Seed hole of acid-etched 4 hours seeds （40×）. F1， F2， F3， F4： Longitudinal structure of the outer seed coat of untreated seeds （300×）， longitudinal structure of the medium seed coat （600×）， longitudinal structure of the inner seed coat （1200×）， longitudinal structure?of?the seed top （160×）.

2.3皇后帝王花種子的透水性

由圖3可看出，皇后帝王花種子的吸水過程可大致分為3個時期，即快速吸水期（0～14?h）、緩慢吸水期（15～50?h）、近飽和期（51～92?h）。種子浸泡2?h后，二者吸水率迅速增長，完整干種子吸水率為21.13%，酸蝕0.5?h種子吸水率達15.29%。由此可以看出，完整干種子與酸蝕0.5?h種子在快速吸水期間均能迅速吸水。吸水12?h后，完整干種子比酸蝕0.5?h種子的吸水率高6.01%，吸水50?h時，二者吸水率分別達41.03%、34.82%，近飽和期，二者吸水率小范圍波動保持平穩，當吸水92?h后，完整干種子的吸水率比酸蝕0.5?h種子的吸水率高出6.35%。方差分析顯示，二者吸水率差異達極顯著水平（F=8.05，p=0.008）。

結果表明，皇后帝王花種皮具有一定的透水性，飽和所需的吸水時間較長，這可能是由于木質化的種皮較厚所致。同時，吸水達到飽和時，完整干種子吸水率高于酸蝕種子吸水率的原因很可能是因為完整干種子的種皮完好無損，種子主要靠種孔吸收水分，因此吸水后不易失水。

2.4皇后帝王花種子的含水量

如圖4所示，在種子吸水達飽和后，完整干種子的種皮含水量為33.68%，酸蝕0.5?h種子的種皮含水量為30.32%。因此，對皇后帝王花種子進行酸蝕處理，并不能改善種皮透水性，提高種皮含水量。與對照組相比，完整干種子和酸蝕0.5?h種子的胚均能吸收部分水分。在種子吸水飽和后，完整干種子和酸蝕0.5?h種子胚的含水量分別比對照種子的胚高10.80%、9.95%。方差分析表明，完整干種子和酸蝕0.5?h種子胚的含水量無顯著

差異（F=1.97，p=0.232），說明對皇后帝王花種子進行酸蝕處理，亦不能增加種胚含水量。由此可見，皇后帝王花種皮對種子吸水的限制并非引起其休眠的主要因素。

3??討論

皇后帝王花種子的種皮有3層，外種皮表面角質化，內有細胞壁強烈增厚的單層柵欄細胞，其結構致密，存在阻礙氣體和水分自由擴散的可能;中種皮最厚，其細胞高度木質化且排列緊密;內種皮較薄，由難透水的蠟質形成一層保護膜。這種厚實而堅硬的種皮結構使皇后帝王花種子在山火頻發的原產地得以留存，等待山火過后雨季來臨再次重生^[12]。諸多研究表明，濃硫酸處理可有效打破種子的物理休眠^[13-16]。經濃硫酸處理后，皇后帝王花種子表面結構疏松，角質層、柵欄層逐漸被腐蝕，形成大小不同的孔洞，但濃硫酸處理4?h后種子內部受損。因此在對皇后帝王花種子進行酸蝕處理時，時間控制在0.5～2 h，既可減小種皮的機械束縛又不會傷及胚。

在種子透水性實驗中，完整干種子和酸蝕0.5?h種子在前14?h均能迅速吸收水分，而后進入緩慢吸水階段，達到飽和狀態的吸水時間較長，這可能是由于外種皮致密的柵欄層及厚實的中種皮的存在。準噶爾山楂^[17]、歐洲冬青^[18]、野生大豆^[19]等種子的種皮中也有類似的柵欄結構延緩了種子吸水速度。含水量測定表明，完整干種子和酸蝕0.5?h種子的胚均能吸收到部分水分。可見，皇后帝王花種皮結構不是引起其休眠的主要原因，但它對種子解除休眠后胚的萌發，特別是胚根突破種皮是否存在阻礙還有待后續研究的探討。

張俊杰等^[20]對金絲李種子休眠的研究中發現，金絲李果實成熟后，為應對夏季潮濕多雨的環境而逐漸形成特殊種子結構，張海波等^[21]在研究小擬南芥生態適應性中也有相似發現。皇后帝王花在原產地多生長于高山、低山山地及山坡^[22]，那里降水較少，且多集中于冬季，堅硬的種皮使其長期保存生活能力^[23]，這是皇后帝王花在不斷適應自然環境變化過程中形成的保存種源的特異遺傳性^[24]，本研究通過對皇后帝王花種子種皮結構的觀察也證實了這一特性。在自然狀態下皇后帝王花種子萌發困難，萌發時間長^[25]，除去它堅韌的種皮透性較差這一原因，其種胚發育、內源抑制物及種子萌發激素等有關內容尚待進一步研究。

參考文獻

[1]?陳 ?靜.?飽和D最優設計法在帝王花‘Pink ice扦插中的應用[M].?北京： 中國林業出版社， 2011： 430-434.

[2]?Sauquet H， Cantrill D J.?Pollen diversity and evolution in Proteoideae （Proteales： Proteaceae）[J]. Systematic Botany， 2007， 32（2）： 271-316.

[3]?Wasson E， Rodd T.?世界園林喬灌木[M].?北京： 中國林業出版社， 2004： 302-322.

[4]?Rodríguez-Pérez J A， Corbella-Tena M. Effect of salinity on seedling emergence of?Protea compacta，P. cynaroides， and?P. magnifica（Proteaceae）[J]. Journal of Plant Nutrition， 2011， 34（13）： 1930-1939.

• 范賢熙， 胡 ?秀， 王 ?奇， 等. 木本切花植物極美泰洛泊的組織培養研究[J]. 西部林業科學， 2006， 35（2）： 86-89
• 王 ?奇， 胡 ?秀， 范賢熙， 等. 多花白澳山龍眼組織培養研究[J]. 江西農業大學學報， 2006， 28（5）： 665-668.
• 盧珍紅， 段曉梅， 樊國盛. 山龍眼科木本切花市場現狀與生產前景分析[J]. 福建林業科技， 2007， 34（2）： 243-246.
• 羅昌國， 樊國盛， 趙曉偉， 等.?不同處理對山龍眼花卉紅花盧卡樹種子的發芽影響[J]. 種子， 2009， 28（1）： 15-17.
• 羅昌國， 袁啟鳳， 樊國盛， 等.?3種山龍眼花卉苗木生長特性[J]. 江蘇農業科學， 2010（5）： 224-226.
• 曾 ?力， 樊國盛， 段曉梅. 不同預處理對2種山龍眼科種子出苗率的影響[J]. 福建林業科技， 2009， 36（3）： 141-144.
• 楊期和， 葉萬輝， 宋松泉， 等.?植物種子休眠的原因及休眠的多形性[J]. 西北植物學報， 2003， 23（5）： 837-843.
• Brown N A C， Botha P A， Staden J V. Smoke seed germination studies and a guide to seed propagation of plants from the major families of the Cape Floristic Region， South Africa[J]. South African Journal of Botany， 2004， 70（4）： 559-581.

[13]?薛婷婷， 沈永寶， 劉 ?嘉， 等. 種子物理休眠研究進展[J]. 植物學報， 2016， 51（6）： 863-871.

[14]?王小雪， 孫海菁， 劉 ?蕓， 等. 濃硫酸處理對海濱木槿10個家系種子萌發的影響[J]. 應用生態學報， 2012， 23（11）： 2968-2974.

[15]?賈 ?娟， 劉 ?芳， 蘇紅田， 等. 不同處理方法對5種豆科牧草種子萌發特性的影響[J]. 草地學報， 2012， 20（2）： 342-347.

[16]?侯文煥， 趙艷紅， 唐興富， 等. 不同處理方法對菜用黃麻種子萌發的影響[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（2）： 231-236.

[17]?張 ?俠， 李 ?進， 呂海英， 等. 準噶爾山楂種殼、種皮、種胚特性與種子休眠的關系[J]. 植物生理學報， 2014， 50（6）： 867-874.

[18]?賈有偉， 魏馳宇， 田如男. 歐洲冬青種皮特性與種子休眠的關系[J]. 江蘇農業科學， 2017， 45（12）： 96-99.

[19]?徐 ?亮， 李建東， 殷萍萍， 等. 野生大豆種皮形態結構和萌發特性的研究[J]. 大豆科學， 2009， 28（4）： 641-646.

[20]?張俊杰， 韋 ?霄， 柴勝豐， 等. 珍稀瀕危植物金絲李種子的休眠機理[J]. 生態學雜志， 2018， 37（5）： 1371-1381.

[21]?張海波， 劉 ?彭， 劉立鴻， 等. 新疆短命植物小擬南芥（Arabidopsis pumila）種子萌發特性及其生態適應性[J]. 生態學報， 2007， 27（10）： 4310-4316.

[22]?Schmid B， Nottebrock H， Esler K，et al. Reward quality predicts effects of bird-pollinators on the reproduction of African Protea shrubs[J]. Perspectives in Plant Ecology Evolution and Systematics， 2015， 17（3）： 209-217.

[23]?王瑩瑩， 周 ?浩， 蘇 ?兵， 等. 攀枝花蘇鐵種子的種皮結構及木質部管狀分子研究[J]. 四川大學學報（自然科學版）， 2011， 48（1）： 247-252.

[24]?潘愛芳. 蘇鐵種子的種皮結構特征研究[J]. 植物科學學報， 2012， 30（5）： 437-442.

[25]?Wu H C， Toit E S D. Effects of temperature， light conditions and gibberellic acid on the in vitro germination ofProtea cynaroidesL. embryos[J]. African Journal of Biotechnology， 2010， 9（9）： 8032-8037.