胡椒蔓和葉粗提物成分分析及對3種農業病原真菌活性研究

趙方方 韓丙軍 李萍萍 馬晨 呂岱竹 謝德芳 羅金輝

摘 ?要??采用氣相色譜-質譜聯用技術對胡椒蔓和葉中化學成分種類及含量進行系統分析，并考察提取物對3種重要農業病原真菌的作用。結果表明，胡椒蔓和葉中化學成分種類復雜，而且減壓濃縮與自然揮發相比得到的種類更多。胡椒蔓中胡椒堿相對含量最高，達到34.97%;胡椒葉中烯類化合物種類繁多，以δ-欖香烯最高，相對含量達到13.268%。除了胡椒堿、烯類等特征性成分，還含有大量如酸酯類、化學結構帶環或橋的酮、醇類化合物以及甾醇類化合物。胡椒蔓和葉提取物在2.5?mg/mL濃度下即對3種農業病原真菌均表現出明顯的抑制作用，其中對番茄早疫病菌的抑制作用最為明顯，而且葉提取物對3種病原菌的抑制作用明顯優于蔓提取物，同時得出2種提取物對3種真菌的毒力回歸方程及EC₅₀等表征參數。研究表明，胡椒蔓和葉在農業病原菌防治中具有良好的開發潛力和利用價值。

關鍵詞 ?胡椒蔓;胡椒葉;化學成分;病原真菌;抑制作用中圖分類號??S567.23??????文獻標識碼??A

Extracts from Tendrils and Leaves of Piper nigrum?Linn.：Components Analysis and Activity to Three Types of Agricultural Pathogenic Fungi

ZHAO Fangfang^1，2， HAN Bingjun^1，2，?LI Pingping^1，4， MA Chen^1，3， LYU?Daizhu^1，2， XIE Defang^1，2，?LUO Jinhui^{1，2，3，4*}

1. Analysis?& Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan?571101， China; 2.?Laboratory?of?Quality?&?Safety?Risk?Assessment?for?Tropical?Products?（Haikou）， Ministry?of?Agriculture?and Rural Affairs， Haikou， Hainan?571101， China; 3.?Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou， Hainan?571101， China; 4.?Quality?Supervision?and?Inspection?Center?of?Tropical?Agro-Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan?571101，?China

Abstract ?The ingredients in the?tendrils and leaves ofPiper nigrumLinn.?were analysed by the GC-MS method， including types and amounts of the chemicals. The activities of the extracts?to three types of critical agricultural fungi were also investigated. The results?showed that abundant volatiles were included?in the tendrils and leaves.?More components were obtained by the way of decompressing concentration?than natural volatilization. Relative content of piperine was the highest in the tendrils， about 34.97%， while?that of olefins compounds were more in?the leaves， represented by δ-elemene at 13.268%. Besides these characteristic components， plenty of fatty acids， esters， ketones and alcohols with rings or bridges were also obtained， as well sterols. The extracts?at the concentration of 2.5 mg/mL evidently inhibited three types of agricultural fungi， most intensively onAlternariasolani. Furtherly， the extracts?of the leaves demonstrated more inhibition on these fungi than the extracts?of the tendrils. Toxic regression equations of the extracts to the fungi and the characterization parameters， such as EC₅₀， were also calculated. Potential exploration and utilization?value of the waste?ofP.nigrumLinn.?in the prevention and treatment of agricultural pathogenic fungi were?indicated by the results.

Keywords ?tendrils?ofPiper nigrumLinn.; leaves?ofPiper nigrumLinn.;?chemical components; pathogenic fungi; inhibition

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.017

胡椒（Piper nigrumLinn.）屬胡椒科胡椒屬多年生常綠藤本植物，是世界上重要的熱帶香辛料作物^[1]。中國胡椒種植面積和產量分別居世界的第6位和第5位，我國自1947年引入胡椒以來已在海南、云南、廣西、廣東和福建等省廣泛種植，其中海南省占據90%以上^[2-3]。胡椒從種植到收獲過程中會產生大量廢棄物，根據在海南省國營東昌農場和東紅農場的布點測算實驗結果顯示，每年每公頃結果胡椒樹在栽培管理過程中對胡椒樹進行整形剪蔓會產生鮮胡椒枝蔓約10?500?kg。但是，目前胡椒廢棄物大都被隨意丟棄，開發不充分，造成巨大的資源浪費^[4]。胡椒栽培管理過程中所產生的主要廢棄物胡椒蔓和胡椒葉中蘊含著豐富的活性化學物質，具有巨大的開發利用價值^[5-10]。

目前，對胡椒的研究大都集中在對胡椒粒和胡椒根中化學成分的分析，而對胡椒廢棄物中化學成分的研究還少有報道^[11-14]。葛暢等^[15]對胡椒鮮果果皮中糖類、有機酸、皂苷等進行了定性分析。張水平等^[16-17]從胡椒葉中分離得到兩種抗氧化活性的物質扁柏脂素和野漆樹苷。王延輝等^[18]對胡椒梗中揮發性成分進行研究，并比較了胡椒梗與胡椒中提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制能力。而胡椒主要廢棄物胡椒蔓及胡椒葉中化學成分及其對農業病原菌的活性研究尚未見報道。

本研究以廢棄胡椒蔓和葉為材料，對其化學成分進行分析，并分別對其提取物進行3種農業病原真菌的抑菌活性研究，以期為胡椒廢棄物高效資源化綜合利用提供理論依據和數據基礎，對避免資源浪費和環境污染，提高胡椒的附加值和利用率，促進胡椒產業化升級都具有十分重要的意義。

1??材料與方法

1.1材料

胡椒蔓和胡椒葉樣品：采集于海南省瓊海市胡椒種植基地，日曬后40?℃烘箱干燥待用。番茄早疫病菌（Alternaria solani）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）由廣東省微生物菌種保藏中心提供。Agilent 7890A-5975氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司），R-210旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司），萬分之一天平（SHIMAZU），恒溫培養箱，95%乙醇（分析純）、甲醇、正己烷、丙酮（色譜純）。

1.2方法

1.2.1??化學成分的提取??采用2種蒸干方法進行化學成分的提取。胡椒蔓和葉樣品分別經小型粉碎機打碎、過篩后，稱取6.5 g樣品于1?L棕色玻璃瓶中，加入600 mL?95%乙醇，超聲2?h后置于通風櫥內浸泡48?h，浸泡液經過濾后收集濾液。方法一：分次吸取濾液至250?mL圓底燒瓶中，置于旋轉蒸發儀上40?℃蒸發至近干，用丙酮定容，過0.22??m濾膜，待測;方法二：將濾液置于蒸發皿中自然揮干，用丙酮定容，過0.22??m濾膜，待測。

1.2.2??氣相色譜條件??色譜柱：DB-1 123-1033（30 m×0.32 mm×1 μm）;升溫程序：200 ℃保持1 min，以15?℃/min升至260?℃，保持10 min，以20?℃/min升至280?℃，保持4 min;進樣口溫度：250 ℃;載氣：氦氣，流速：6.5 mL/min;進樣量：1 μL;進樣方式：不分流進樣。

1.2.3 ?質譜條件??離子源為EI源，離子源溫度為230?℃，接口溫度為250?℃，溶劑延遲時間為2?min，掃描質量范圍為60～550 amu。

1.2.4??乙醇粗提物的制備??稱取300 g樣品于4 L棕色玻璃瓶中，加入4 L?95%乙醇，超聲2?h后浸泡48?h。浸泡液經過濾后收集濾液，減壓蒸發，獲得提取液浸膏置于4?℃冰箱保存備用。

1.2.5 ?抑菌實驗??本研究選取了3種重要的農業病原真菌為研究對象，分別考察胡椒蔓、葉提取物對其抑制作用，實驗采用帶毒平板法進行。預先將斜面培養基上的菌種復蘇在PDA培養基上進行活化，得到接種菌落備用。無菌條件下分別稱取不同量的蔓、葉浸膏，加入二甲基亞砜和吐溫-80進行助溶，待PDA培養基冷卻至45?℃左右（不燙手）時，將定量體積的PDA培養基與浸膏溶液中輕輕混勻，使二甲基亞砜和吐溫-80的體積濃度均為1.5%，提取物的梯度濃度分別為20、10、5、2.5、1.25 mg/L。迅速將混合培養基倒入培養皿中冷凝。選取培養平板上生長狀況一致的菌落，用滅菌的打孔器（直徑4?mm）平板環形打取菌餅，并將菌餅接種至上述帶浸膏的平板上。每個濃度和菌株在平板中接種3個菌餅為平行實驗。對照組除不加提取物浸膏外，其他條件與實驗組一致。所有平板至于恒溫培養箱中28?℃培養。長到合適大小時用十字交叉法對每個菌落直徑測量2次求直徑平均，3個菌落再次取平均，計算抑制率，抑制率=（對照組菌落平均半徑–實驗組菌落平均半徑）/對照組菌落平均半徑×100%。根據提取物濃度和抑制率，使用SPSS 19.0軟件求出毒力回歸方程，并計算EC₅₀值等。

2??結果與分析

2.1化學成分

對胡椒蔓和胡椒葉進行GC-MS分析，方法一與方法二分別提取胡椒蔓和胡椒葉的總離子流見圖1。從圖1中可以看出，胡椒蔓和胡椒葉的化學成分非常復雜，經NIST標準譜庫數據系統分析處理，均得到100多種組分，按照面積歸一法確定各組分的相對百分含量，其中匹配度在90%以上的物質對應的化合物見表1和表2，2種方法提取胡椒蔓和胡椒葉中化學成分的相對含量見圖2。由表1和表2可知，方法一與方法二提取胡椒蔓分別鑒定出34和14種化合物，提取胡椒葉分別鑒定出43和11種化合物。方法一（減壓濃縮法）更能保留胡椒蔓和胡椒葉中大部分特征化合物。

由表1和圖2A可以看出，胡椒蔓中主要化學成分是胡椒堿、烯類（如石竹烯、欖香烯、芹子烯）、酸酯類（如肉豆蔻酸、亞油酸乙酯）、

醇類（如3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、葉綠醇）、甾醇類（如菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇）及酮醛類等，其中胡椒堿占大多數，方法一和方法二中胡椒堿相對含量分別達到34.97%和34.06%。

由表2和圖2B可以看出，胡椒葉中主要化學成分是烯類（如欖香烯、（+）-香橙烯、石竹烯、α-古巴烯、α-蓽澄茄油烯、a-古云烯等24種化合物）、胡椒堿、醇類（如合金歡醇、橙花叔醇、斯巴醇等）、甾醇類（γ-谷甾醇）、酸酯類（如棕櫚酸、香茅酸甲酯等）、酮醛類等，其中烯類化合物占大多數，方法一中相對含量達到28.84%，以δ-欖香烯最高，相對含量達到13.268%。

胡椒植株具有獨特的辛香氣味，這與其體內的化學成分具有重要的關系，特別是烯類、醇類和酸酯類化合物對其氣味起著重要作用;而胡椒堿是胡椒具有辛辣味的主要來源之一。另外，有很多物質如石竹烯、欖香烯、α-蓽澄茄油烯、胡椒堿、斯巴醇、香茅酸甲酯等具有抑菌的生物活性^[19-20]。此外，還有谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等甾體類可能在其生長過程中產生重要作用。

2.2提取物抑菌效果

實驗結果表明，胡椒蔓和葉的提取物對這3種病原真菌生長均呈現出一定的抑制作用，不僅菌落擴展半徑受到明顯抑制而且菌絲密度顯著降低，而且隨著提取物濃度增加，抑制作用加強，呈現出良好的量效關系（圖3，圖4）。3種病原菌中，對番茄早疫病病原菌的抑制效果最為明顯，2.5?mg/mL的胡椒蔓提取物對番茄早疫病病原菌的抑制即超過35%，而對灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀

菌的抑制效果相對較低，但效果仍然比較明顯，濃度為10 mg/mL時對其抑制率分別為41%和36%。與胡椒蔓提取物相比，胡椒葉提取物的抑制作用更突出，2.5?mg/mL的葉提取物對番茄早疫病病原菌的抑制率即超過胡椒蔓提取物10?mg/mL的效果，達到55%。10 mg/mL的葉提取物對另外2種真菌的抑制率也超過了50%。實驗結果表明，胡椒葉提取物對這3種病原真菌的抑菌效果比胡椒蔓好，這可能與其所含有的多種烯類化合物如欖香烯、石竹烯有關，文獻報道這些成分具有明顯的抗菌效果^[21-22]。表3中計算出了胡椒蔓和葉提取物對3種病原菌的毒力方程及EC₅₀值，線性相關度良好，其中蔓的浸提物對灰葡萄孢菌和腐皮鐮刀菌的抑制效果相對較差，而且濃度效應不明顯，因此其EC₅₀值的誤差相對較大，故表中將其省略。

本研究所采用的3種病原菌是在農業生產中引起嚴重損失的重要種類，能夠引起果樹，蔬菜、花卉、茶葉等百余種作物的病害，造成較為嚴重的危害^[23-25]。實驗結果表明，胡椒修剪所產生的廢棄物所含的化學成分均能夠起到較為明顯的抑制作用，能夠為植物病蟲害的生物防治和綠色防控提供較為有效的研究材料，可以應用于有機食品及無公害農產品生產中的病蟲害防控研究，同時，作為農田廢棄物價廉易得，在農業生產中較為合適，具有較大的應用潛力和開發價值。

3??結論

本研究以胡椒修剪過程中產生的廢棄物胡椒蔓和葉為研究對象，采用氣相色譜-質譜聯用技術分別對其乙醇提取物中化學成分進行研究。結果表明，其成分復雜，涉及化合物種類眾多，不僅含有胡椒的多種特征性組分，而且還含有具有抗菌活性的揮發性物質。進一步將蔓和葉提取物添加到培養基中，考察其潛在的抗菌效果。通過對比實驗，發現其對于包括番茄早疫病病原菌在內的3種重要的農業病原真菌具有較好的抑制作用。

隨著綠色農業和可持續發展理念的推進，病蟲害的綠色防控技術勢在必行，這就需要開發大量的天然抗菌材料。本研究證明了胡椒廢棄物具有較好的抗菌活性，具備成為抗菌天然材料的潛力。同時，胡椒在生產過程中需要定期進行枝條修剪，剪掉的部分通常被視為廢棄物丟棄，長期大面積的種植會產生大量的枝蔓廢棄物，造成資源的巨大浪費。本研究使用乙醇浸提的方法，操作簡單，成本低廉，對環境無污染，適合在農業生產中應用，可以為作物病蟲害生物防治和綠色農業的發展提供有效的材料。同時，這一理論研究符合農業“兩減”的政策和目標要求，符合綠色和可持續農業的概念，具有潛在的開發和利用價值。

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