中國木薯白點病發生調查及病原生物學特性研究

蔡吉苗 時濤 李超萍 王國芬 陸翠梅 黃貴修

摘 ?要??2007—2018年，本課題組在對中國木薯主栽區的病害調查中發現了一種國內尚未記載的葉斑病。病害主要危害葉片，形成圓形或不規則形、常密集分布的白色至黃褐色的病斑，故命名為白點病。該病在云南、海南、廣西等地區均有發生，絕大多數主栽品種和部分新育成種質均受害。經病菌分離和回接實驗以及病菌形態觀察、核糖體基因間隔區和β-微管蛋白基因序列分析，將該病病原鑒定為鏈格孢（Alternaria alternata）。病菌離體培養實驗表明，菌絲生長最適條件為V9、OA、CA或CMA培養基，28?℃，D-麥芽糖、D-山梨醇或D-乳糖，硝酸鈉，光暗交替，pH 8。分生孢子萌發最適溫度為28?℃，而致死溫度為60?℃處理5?min。殺菌劑敏感性測定結果表明，在所測試的10種藥劑中，10%苯醚甲環唑WG和25%吡唑醚菌酯WG的EC₅₀值分別為0.12、0.47?mg/L，對菌絲生長抑制率最高。

關鍵詞 ?木薯白點病;鏈格孢;生物學特性;殺菌劑中圖分類號??S435.33??????文獻標識碼??A

Survey， Pathogen Identification of a White Spot Disease on Cassava and Its Biological Characteristics in China

CAI Jimiao， SHI Tao， LI Chaoping， WANG Guofen， LU Cuimei， HUANG Guixiu^*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural?Affairs?/ Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?During cassava disease survey from 2007 to 2018， one new leaf spot disease was found in the main cassava planting areas of China. The pathogen mainly infected the cassava leaves with densely formed round or irregular， white to tawny lesions. The disease was widely happened in Yunnan， Hainan， Guangxi and some other provinces， and most of the main cassava planting varieties and part of late breeding germplasms were also infected. The results of pathogen isolation， pathogenicity test， strain morphology observation， sequences analysis of Internal Transcribed Spacer and beta-Tubulin gene showed the disease was caused byAlternaria alternata. The pathogen in vitro cultured showed V9， OA， CA or CMA medium， 28?℃， D-maltose， D-sorbitol or D-lactose， NaNO₃， alternative light and pH?8 were the optimum conditions for mycelial growth. The optimum temperature for conidia germination was 28?℃?and the lethal temperature for conidia was 60?℃?remained for 5 min. Sensitivity test confirmed 10% difenoconazole WG and 25% pyraclostrobin WG had the best mycelium inhibition effect from 10 fungicides， and the EC₅₀value was 0.12 mg/L and 0.47 mg/L， respectively.

Keywords ?cassava white spot disease;Alternaria alternata; biological characteristics; fungicides

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.019

木薯（Manihot esculentacrantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬灌木狀多年生作物，起源于熱帶美洲地區，有4000多年的栽培史。1820年前后，木薯首次從東南亞傳入中國廣東，目前種植范圍已遍及華南地區，是當地農業經濟重要的組成部分。廣西、海南、廣東、云南、江西等地區為中國木薯主栽區，山東^[1]、河北、河南、北京、新疆^[2]等地的小范圍試種也取得了成功。木薯在我國主要用作工業原料，可生產變性淀粉、化工產品、淀粉糖等大量產品^[3]。據農業部發展南亞熱帶作物辦公室統計，2015年中國木薯種植面積約34.87萬hm²， 干薯總產量271.42萬t^[4]。中國的木薯生產不能自給，自2005年起一直是世界上最大的進口國^[5]。2016年，中國進口木薯干片和木薯淀粉分別達到770.43和207.31萬t，占世界木薯干片和木薯淀粉進口總量的60.47%和52.03%。國內木薯種植業對保障相關產業健康發展具有重要意義。

前期研究表明，目前危害我國木薯的葉部病害主要有細菌性萎蔫病、褐斑病、炭疽病^[6]、棒孢霉葉斑病^[7]、離蠕孢葉斑病^[8]和藻斑病^[9]。這些病害均有其典型癥狀，細菌性萎蔫病為角型病斑，褐斑病為黃褐色病斑，炭疽病發生后病葉常扭曲、干枯，棒孢霉葉斑病為中央略呈白色紙質狀、邊緣黑褐色而且周圍有明顯黃色暈圈的圓形病斑，離蠕孢葉斑病為中央有同心輪紋、邊緣深褐黃色的圓形或近圓形病斑，而藻斑病為近圓形、中央灰白色毛氈狀病斑且僅在生長末期發生。2007年以來，本課題組在對中國木薯病害的調查中，發現了一種和國內已報道葉部病害不同的葉斑病。病原菌主要危害葉片，侵染后形成圓形或不規則形、白色至黃褐色、常密集分布的病斑，其癥狀與國外記載的white leaf spot相似^[10]，因此命名為白點病。目前該病在中國木薯主栽區普遍發生，部分地點嚴重為害，是生產中值得關注的一個新問題。目前國外對white leaf spot僅有發生記載，其病原鑒定、防治關鍵技術等均為空白，因此本課題組開展了該病害的發生調查、病原鑒定、病原生物學特性及防治藥劑篩選等方面研究，為相關防控工作的進一步開展提供基礎。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1??木薯品種和白點病病樣??木薯品種華南10號由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種與資源研究所提供。木薯白點病病樣采自海南省?？谑醒葚S鎮發病的華南10號木薯發病葉片。

1.1.2??培養基和試劑??菌株培養選用V9、Czapek、PDA、CMA、CA、PSA、OA、EMA、LB等培養基，配方參見《植病研究方法》^[11]。DNA片段膠回收試劑盒和pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP和大腸桿菌JM109感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司;引物對ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TC?CTCCGCTTATTGATATGC-3′^[12]，Tub2-u：5′-GA?GAAAATGCGTGAGATTGT-3′?和Tub2-d：5′-TG?GTCAACCAGCTCAGCACC-3′^[13]由北京六合華大基因科技股份有限公司合成;其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 ?殺菌劑??共10種，其中可濕性粉劑（WP）共6種，水分散粒劑（WG）3種，水劑（AS）1種，其種類、濃度等見表1。

1.2方法

1.2.1 ?木薯白點病發生調查??參考李超萍等^[6]的方法，于2007—2018年對中國木薯主要種植區進行調查。采取5點取樣法，每個點選擇30株植株，觀察植株上的葉片發病情況，計算株發病率。

1.2.2??木薯白點病病原分離??田間采集植株典型病葉，參照文獻[11]的方法分離和純化病原菌。

采用孢子液噴霧法進行病原菌致病性測定。選擇地勢平坦、土質疏松、土壤肥力中等的田塊，采用常規方法種植木薯5個月。將病原菌在PDA平板上28?℃光照培養7 d后，用滅菌棉簽將菌落表面孢子洗下，用滅菌的3層擦鏡紙濾去菌絲，將分生孢子調至1×10⁴個/mL。田間選取完全展開、健康完好的木薯葉片，進行噴霧接種，以無菌水為對照。葉片接種后用保鮮袋進行保濕處理，48 h后去掉保鮮袋，每7 d觀察一次，待病害發生后，觀察其癥狀并從發病部位重新分離病原菌，觀察菌落特征以及分生孢子形狀，與最初分離且接種發病的菌株做對比，確認分離物的致病性。

1.2.3 ?木薯白點病病原鑒定、生物學特性研究和殺菌劑篩選??參照時濤等^[14]方法進行病原菌落形態、分生孢子等結構的觀察和測量、ITS序列分析、生物學特性以及殺菌劑配制、室內毒力測定等方面研究。生物學特性測定中，各處理5個平板，重復3次，計算平均數和標準差，并用SAS?9.0軟件進行差異顯著性分析^[15]。

2結果與分析

2.1木薯白點病的發生調查

經過多年度多次調查，發現木薯白點病在海南省儋州市、?？谑?、文昌市、白沙縣和瓊中縣，廣西壯族自治區北海市、南寧市、桂平市、平南縣，廣東省遂溪縣、雷州市，云南省保山市，江西省撫州市，福建省大田縣以及貴州省望謨縣等地區普遍發生，已經成為當地木薯種植中的常見病害（表2）。

病害通常在木薯生長中期，7月以后開始發生，隨后流行為害，后期隨著氣溫下降逐漸減輕。當前主栽的華南系列、桂熱系列、南植系列等絕大多數主栽品種以及新育成的H1071、JG1301等種質均受害。在病害流行高峰期，云南保山地區的華南205、桂熱4號，廣西武鳴地區的H1071、桂熱4號和南植199，海南?？诤臀牟貐^的華南10號等品種（或種質）的株發病率均在70%以上。

田間條件下，病原菌主要危害葉片，通常中下部葉片最先受害，隨后向上擴展。葉片受侵染后，形成近圓形或不規則形的病斑。病斑最初為白色，后期黃褐色，直徑1.5～7.0 mm，其邊緣下陷，厚度約為正常葉片的一半（圖1）。病斑背面邊緣通常為褐色，周圍有黃色暈圈，田間濕度大時可見灰白色點狀物，為病原菌子實體。病斑在葉片上常成片密集分布，生長后期偶有單獨分布。

發病葉片隨后變黃，提前脫落。不同品種之間病斑的大小、顏色、落葉情況等略有差異。病害嚴重發生時，中下部葉片大量脫落，嚴重影響木薯的長勢和產量。

調查中發現，華南10號和H1071受害尤為嚴重，植株受侵染后，中部和下部絕大部分葉片上出現大量密集分布的白色至黃褐色的典型病斑。2015年廣西武鳴地區的H1071和2017、2018年海南文昌的華南10號植株受害后發病葉片大量脫落。

2.2木薯白點病病原菌的分離和致病性鑒定

2016年10月，在海南省?？谑醒葚S鎮受害木薯華南10號植株上采集白點病病樣，病原菌分離并經單孢純化后，編號為CAAHN01。2017年8月，在種植5個月的華南10號木薯植株上，采用孢子液噴霧法對中下部葉片進行接種，14 d后接種葉片上形成密集分布、和田間癥狀類似的白色至黃褐色小病斑，而接種無菌水的對照葉片無任何癥狀（圖2）。從接種后病斑上重新分離獲得了培養性狀和分生孢子形態與最初分離物一致的分離物，表明該菌株為該病的致病菌。

2.3木薯白點病病原菌的鑒定

2.3.1 ?CAAHN01的形態觀察??在PDA平板上，CAAHN01菌落為圓形，邊緣整齊，中間灰色，邊緣白色，氣生菌絲和基內發達（圖3）。菌絲分隔，多分枝。分生孢子梗為單生或簇生，直或彎曲。短喙柱狀，淡褐色。分生孢子大小為27.2～ 40.0?μm×8.1～12.8 μm，單生或短鏈生，倒棍棒狀或倒梨形，淺褐色或褐色，具有3～7個橫隔膜和1～3個縱、斜隔膜，多數為3～5個橫隔膜，分隔處略隘縮（圖4）。根據上述形態特征，參考張天宇^[16]的描述，初步鑒定該病原菌為鏈孢霉目（Moniliales）黑霉科（Dematiaceae）鏈格孢屬（Alternaria）的鏈格孢（Alternaria alternata）。

Tub2-u和Tub2-d引物對進行PCR擴增，均獲得大小約0.6 kb的目的片段。擴增產物用ITS1和Tub2-d引物進行測序后，分別獲得566和533 nt，序列已提交NCBI數據庫，登錄號為MH572535和MH572536。序列比對結果表明，MH572535與分離自受污染木制雕塑的鏈格孢菌株Su-VIII-1序列（MF475920）完全一致^[17]，與侵染黑色苦莓的鏈格孢菌分離物15-322（LC131450）和15-246（LC131446）、侵染葡萄的菌株HMY 2-1（KJ739880）的序列同源性為99%，而MH572536和侵染紫花苜蓿的鏈格孢菌株MP23（KJ396336）和MP39（KJ396337）、侵染枇杷的鏈格孢菌株PAK38（KY126829）、侵染茶樹的菌株CS36-5（KY814630）和CS36-3（KY814628）（未發表資料）的同源性為99%，進一步從分子水平證明其為鏈格孢。

2.4菌株CAAHN01的生物學特性測定

菌株培養結果表明，菌株CAAHN01在V9、Czapek、CMA、PDA、CA、PSA、OA、LB和EMA等培養基上均能生長，其中V9、OA、CA和CMA上生長速度最快（圖5A）。在分別添加不同的8種碳源或6種氮源的Czapek培養基平板上，CAAHN01均能生長，其中以D-麥芽糖、D-山梨醇、D-乳糖為碳源以及以硝酸鈉為氮源的條件下生長最快（圖5B，圖5C）。在PDA培養基平板上，菌株在4～37?℃均能生長，但28?℃生長速度最快（圖5D）;光暗交替和pH 8條件下，菌落生長速度最快（圖5E，圖5F）。分生孢子在10～40?℃均能萌發，28?℃時萌發率最高（圖6A），致死溫度為60?℃處理5 min（圖6B）。

2.5室內殺菌劑篩選

10種殺菌劑的各處理濃度對數與生長抑制率幾率值之間呈線性相關，其濃度對數-抑制率幾率值的毒力回歸方程、相關系數、和EC₅₀等見表3。從表3中可以看出，10%苯醚甲環唑WG和25%吡唑醚菌酯WG抑菌效果優于其他殺菌劑，EC₅₀≤0.47?mg/L，其中10%苯醚甲環唑WG的EC₅₀最小。50%異菌脲WP和14%咪鮮胺錳鹽WP的EC₅₀≤2.04 mg/L，優于其他6種殺菌劑。2%春雷霉素AS的EC₅₀為11.41 mg/L，優于其他4種。80%代森錳鋅WP和80%烯酰嗎啉WG的EC₅₀≥48.87 mg/L，效果僅優于75%百菌清WP、50%多菌靈WP和70%甲基托布津WP，而這2種殺菌劑的EC₅₀≥2276.38 mg/L。10種殺菌劑的抑菌效果排序為：10%苯醚甲環唑WG（三唑衍生物類）>25%吡唑醚菌酯WG（甲氧基丙烯酸酯類）>50%異菌脲WP（二甲酰亞胺類）>14%咪鮮胺錳鹽WP（咪唑類）>2%春雷霉素AS（農用抗生素類）>80%代森錳鋅WP（取代苯類）>80%烯酰嗎啉（嗎啉類）WG>75%百菌清WP（取代苯類）>50%多菌靈WP（苯并咪唑衍生物類）>70%甲基托布津 WP（取代苯類）。

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