基于HS-SPME-GC-O-MS的西番蓮果汁香氣成分分析方法

龍倩倩 林麗靜 袁源 龔霄 李國鵬 馬麗娜 李積華 黃葦

摘 ?要??因西番蓮果汁具有多種水果的濃郁香味，可建立更全面的氣相色譜-質譜聯用檢測條件。利用氣相色譜-嗅聞-質譜聯用（GC-O-MS）技術確定西番蓮果汁中14種香氣主要揮發性成分，再結合頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）分析不同萃取條件下西番蓮果汁的香氣主要揮發性成分，建立萃取方法。通過實驗分析，得到條件如下：未添加氯化鈉的西番蓮果汁，取汁量為0.5 mL，65 μm DVB/PDMS萃取頭，萃取溫度40?℃，萃取時間20 min，解吸時間5 min。鑒定得到62種揮發成分，包括酯類、醇類、烯類、酮類化合物，其中酯類化合物為71.58%，是西番蓮果汁香氣的主要貢獻化合物類，此檢測方法有效可行。

關鍵詞 ?西番蓮;頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）;香氣成分;氣相色譜-嗅聞-質譜聯用（GC-O-MS）中圖分類號??S667.9??????文獻標識碼??A

Analysis Conditions of Volatile Aroma Components in Passion Fruit Juice by HS-SPME-GC-O-MS

LONG Qianqian^1，2，3， LIN Lijing²， YUAN Yuan²， GONG Xiao²， LI Guopeng²， MA Lina²， LI Jihua²，HUANG Wei^1*

1. College of Food Sciences，?South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China;?2. Agricultural Product Processing Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524001， China;?3. Tongren Institute for Food and Drug Control， Tongren， Guizhou 554300， China

Abstract ?Passion?fruit?juice has rich aroma of various?fruits， and it is possible to establish more comprehensive conditions for gas chromatography-mass spectrometry. The main components of 14 types of?aroma from passion fruit juice were determined by gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry?（GC-O-MS）， and the main aroma components under different extraction conditions were analyzed by head space-solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry?（HS-SPME-GC-MS）. Through experimental analysis，?the conditions was as follows： passion fruit juice without NaCl 0.5 mL， extraction fiber 65 μm?DVB/PDMS， extraction temperature 40?℃， extraction time 20 min， desorption time 5 min. Sixty-two volatile components were determined， including esters， alcohols， alkenes and ketones， and the esters （71.58%）， which dominated the aroma of passion fruit?juice，?this method was effective and feasible.

Keywords ?passion fruit; head?space-solid?phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME- GC-MS）; volatile aroma components;?gas chromatography-olfactometry-mass?spectrometry （GC-O-MS）

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.024

西番蓮（Passiflora caeruleaL.）是西番蓮科西番蓮屬的多年生常綠藤本植物，原產于巴西，目前在東南亞、澳洲、南美洲及非洲南部等熱帶、亞熱帶地區廣泛種植，其中巴西是世界上西番蓮鮮果和加工品最大的生產國和消費國，主要種植品種為黃果西番蓮^[1]。西番蓮為一年多次成熟植物，果實采收期長，有9個多月，隨熟隨采隨時供應^[2]。西番蓮果除食用以外，同時具有保健功能，如活血強身、滋陰補腎、生津止渴等^[3]。因西番蓮果汁的香味中含有165種芳香化合物而被譽為世界上最芳香的水果，是飲料加工的優質原料^[4]。所以，研究西番蓮果汁香氣成分，建立檢測方法，對進一步研究選擇西番蓮的品種、產品加工、香氣合成都有極其重要的意義。

固相微萃取（SPME）技術可以靈活應用于富集氣體、液體、固體等多種樣品中的各類揮發性或半揮發性物質分析^[5]，具有樣品制備方便、快捷，不使用有機溶劑，且樣品用量少，能較為真實地反映樣品本身的揮發性成分等優點^[6]，所以固相微萃取在近幾年應用研究頗多，但建立的多數是手動進樣的方法^[7-9]。手動進樣易導致人為誤差，需要的樣品量遠大于自動進樣，自動進樣可盡量避人為誤差。目前，西番蓮果汁中少量成分未見標準品，依靠質譜檢索存在不確定性，因不同的GC-MS性能和分離柱柱效有差異，分離效果有所不同^[10]。故采用保留指數（retention index，RI）法^[11]結合質譜檢索可增加定性的可信度，解決定性不夠準確的問題。國內研究大多通過揮發性成分總峰面積建立相關檢測方法，整體揮發性成分不全代表整體香氣成分，忽略其揮發性成分的香氣閾值。利用GC-O-MS通過人嗅覺感知選取與西番蓮果汁特征香味有關成分，體現香氣變化趨勢從而建立檢測方法，解決以往研究不能覆蓋使用以及不夠全面的問題。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?原料??鮮紫果西番蓮（廣西南寧，2016年9月產），手工過濾，經4層紗布過濾去籽取汁，于–80?℃冰箱冷凍待測。

1.1.2 ?儀器設備??QP2010-Plus氣相色譜-質譜聯用儀（配有AOC-5000頂空，固相微萃取及液體注射器三合一自動進樣器），日本島津公司;GC7890A-MS5925C氣相色譜-質譜聯用儀，美國Aglient公司;嗅聞裝置（ODP2），德國Gerstel公司;SPME萃取頭（Divinylbenzene/Carboxen/?Polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS，50/30 μm;Div inyl benzene/Polydimethylsiloxane，DVB/PDMS，65 μm;Carboxen/Polydi methyl silo xane，CAR/PDMS 85?μm;Polydimethylsiloxane，PDMS，100?μm;Pi lyacrylate，PA，85 μm），美國Supelco公司。

1.2方法

1.2.1 ?氣相色譜-質譜聯用條件??色譜柱：VF-wax毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;升溫程序：45?℃保持2 min，以5?℃/min升至180?℃，再以20?℃/min升至240?℃，保持5 min;載氣（He）流速1 mL/min;壓力100.0 kPa;不分流;進樣口溫度250?℃。電子轟擊離子源（EI）：電子能量70 eV;接口溫度250?℃;離子源溫度230?℃;檢測器增益電壓1.25?kV;質量掃描范圍m/z?30～?350。萃取頭萃取條件：取已過濾的西番蓮果汁少量，分別移取0.5 mL于20 mL頂空進樣瓶中。將進樣瓶放置在50?℃溫度控制攪拌器中以250?r/min轉速動態平衡15?min;再在上述條件下將萃取頭插入進樣瓶動態萃取15?min;然后GC-MS進樣，解吸溫度250?℃，解吸時間5?min。

1.2.2 ?氣相色譜-嗅聞-質譜聯用測定條件??用與1.2.1節相同的分析條件進行分離，流出物在毛細管末端以1∶1的分流比分別流入質譜檢測器和ODP嗅聞裝置。挑選出經聞香訓練的實驗人員3名，用時間強度法進行GC-O-MS分析，并記錄保留時間和化合物的香氣強度和特征，香氣強度按1～5共5個等級記錄^[12]。“1”表示能感受到香氣，“2”表示可以聞到強于“1”的香氣但氣味不明顯，“3”表示該氣味成分強度適中且氣味明顯，“4”表示味道強度略大，較強烈，“5”表示氣味明顯且強烈。每人做3次檢測，同1人記錄1個成分2次以上且3人共有同1個記錄才認作有效記錄，香氣強度為3人記錄的平均值。

1.2.3 ?保留指數（RI）值的測定??以C₇～C₃₀正構烷烴混合標準品配制濃度為0.1%的溶液，采取與1.2.1節相同的分析條件進行分離，通過測定各正烷烴的保留時間來計算各成分的RI。各成分的RI值根據Kovats公式^[11]進行計算：

式中，RI為被測成分的保留指數;t_x為被測成分流出峰的保留時間（min）;t_n為碳原子數為n的正構烷烴流出峰的保留時間（min），t_n+1為碳原子數為n+1的正烷烴流出峰的保留時間（min），且t_n<t_x<t_n+1^[12]。

1.2.4 ?SPME方法建立??（1）萃取頭選擇。選取5種不同的萃取頭，分別為50/30?μm DVB/CAR/?PDMS（DCP），65?μm的DVB/ PDMS（DP），85?μm的CAR/PDMS（CP），100?μm的PDMS，85?μm的PA。新萃取頭在使用前預老化1?h。取少量已過濾的西番蓮果汁，與1.2.1節相同的分析條件進行分離。

（2）果汁量的選擇。取少量已過濾的西番蓮果汁，分別移取0.4、0.5、0.6、0.7、0.8?mL于20?mL頂空進樣瓶中。使用DVB/ PDMS萃取頭，其他條件同1.2.1節。

（3）氯化鈉添加量的選擇。取少量已過濾的西番蓮果汁，移取0.5 mL于20 mL頂空進樣瓶中，分別添加氯化鈉0、0.05、0.10、0.15、0.20 g。使用DVB/ PDMS萃取頭，其他條件同1.2.1節。

（4）萃取溫度的選擇。移取0.5?mL西番蓮果汁于20 mL頂空進樣瓶中，不加入氯化鈉，將進樣瓶分別放置在40、50、60、70、80?℃溫度控制攪拌器中以250?r/min轉速動態平衡15?min;使用DVB/ PDMS萃取頭，其他條件同1.2.1節。

（5）萃取時間的選擇。取0.5?mL西番蓮果汁于20 mL頂空進樣瓶中，不加入氯化鈉，將進樣瓶分別放置在40?℃溫度控制攪拌器中以250?r/min轉速動態平衡時間15 min;再在上述條件下將萃取頭DVB/PDMS插入進樣瓶分別動態萃取5、10、15、20、25?min;GC-MS進樣，其他條件同1.2.1節。

2??結果與分析

2.1 ?GC-O-MS技術結合保留指數為西番蓮主要揮發性成分定性

利用GC-O-MS可直接檢測出有香味的成分，可大致判斷出其成分的閾值，對香氣進行大致描述，而保留指數結合質譜匹配度共同定性，大大提高了成分的定性可信度^[12]。表1為通過GC-O-MS以及保留指數做參考，從而確定14種具有香氣且對整體香味具有較大影響的揮發性成分。

2.2萃取頭的選擇

萃取頭DCP和DP富集效果遠大于其余3種萃取頭（圖1），DP和CP的主要揮發性成分峰面積百分比最高（表2），綜合比較選取DP較好。

據報道，β-紫羅蘭酮的含量對西番蓮果汁的香氣有很大影響^[15]，兩者呈正相關;芳樟醇香味較為明顯，是一味持久清新的香氣^[16];羅勒烯有清新花香，易高溫分解，需關注其變化。由圖1可知，在羅勒烯、芳樟醇、β-紫羅蘭酮這幾種成分富集上DP較高于其他萃取頭。而DP好于DCP的原因可能有2個，其一是DP萃取頭為雙極性偏非極性，而本研究選取的這14種主要揮發性成分中非極性的成分稍多，所以萃取頭DP較優;其二可能是由于萃取頭DCP比DP增加1種涂層，雖然可以吸附更多成分，但同時也使得目標主要揮發性成分的峰面積總百分比降低。綜上所述，在西番蓮果汁的萃取頭選取實驗中萃取頭DVB/ PDMS（DP）較優于其他萃取頭。

2.3果汁量的選擇

由于固相微萃取需要較長時間才可達到真正意義上的分配平衡，所以確定果汁量可以無須達到分配平衡，只需保證其他萃取條件相同，萃取成分與原始成分呈正比即可^[17]。隨著果汁量增加，使得分子量小的成分峰面積出現上升后下降的趨勢（圖2），分子量大的成分峰面積呈上升趨勢，對月桂烯、乙酸己酯、乙酸葉醇酯、丁酸葉醇酯、β-紫羅蘭酮等成分影響較小，主要揮發性成分峰面積百分比差異不大（表3），0.5 mL果汁量的主要揮發性成分峰面積百分比相對于其他果汁量要高，不同果汁量下的峰面積無顯著差異，證明自動進樣對果汁量的影響沒有手動萃取因頂空氣體空間限制而導致樣品體積與頂空體積存在的顯著相互關系，但樣品量過大容易造成質譜檢測器飽和，引起定性錯誤，綜合以上考慮，確立自動進樣條件下采用0.5 mL的果汁量。

2.4氯化鈉的選擇

氯化鈉的加入可產生鹽析效應，降低揮發物在水中的溶解性，使得揮發物更易揮發，進入頂空空間，被萃取頭吸附^[18-20]。綜合圖3和表4可知，增加氯化鈉添加量使得分子量小的成分先上升后下降，而相對而言，則呈明顯遞減的趨勢，己酸己酯尤為明顯;羅勒烯呈遞減趨勢，而芳樟醇在添加0.1 g時增加明顯，這可能是因為氯化鈉增大了溶液的離子強度，使得基質降低了對揮發性成分的束縛^[21]，使得芳樟醇從西番蓮中大量揮發出來，增強了萃取的效果。雖然，增加氯化鈉使得西番蓮果汁香氣整體種類和總峰面積有所增加，但是主要揮發性成分總峰面積減少，總峰面積百分比減少，這可能是由于萃取頭可吸附的揮發性成分是有限的，萃取成分增加會導致原有主要揮發性成分比例相應減弱。揮發性成分種類增加的同時也造成了主要揮發性成分物質的峰面積百分比下降，綜合考慮，選擇不添加氯化鈉的原汁作為測試樣品。

2.5萃取溫度的選擇

溫度對西番蓮果汁的主要揮發性成分有較大影響（圖4）。隨著溫度的增加，分子量較小的酯類隨著萃取溫度的升高逐漸減少，在60?℃以上，其他成分也有相同的趨勢。從組成成分來看，40?℃對分子量較小的成分有較好的吸附效果，60?℃對分子量較大的成分有較好的吸附效果，這可能是因為香氣物質與萃取頭之間存在著吸附與解吸的動態平衡，升高溫度加速分子運動，加快香氣物質的傳質速率，使香氣物質易于揮發到頂空氣體中被萃取頭吸附^[21-22]。低溫使得分子量較小的成分先揮發到頂空被萃取頭吸附，分子量較大的成分揮發較少，適當的高溫使得分子量大的成分開始大量揮發至頂空，頂空氣體成分比例發生改變，分子量小的成分萃取頭吸附隨之減少，吸附分子量大的成分則增加，但溫度繼續升高導致主要揮發性成分在頂空氣體所占比例下降，在萃取頭涂層和頂空氣體中的分配系數下降，使得吸附能力下降，這印證了表5中主要揮發性成分總峰面積百分比減少的趨勢。考慮到溫度過高可能使揮發性成分發生一系列的化學變化，不能較好地反映樣品真實的香氣特征，且部分主要揮發性成分在60?℃時萃取到的含量過小，不利于分析，所以選取40?℃作為萃取溫度。若只對其中幾種含量較高的成分進行分析萃取，則溫度為60?℃更佳。

2.6萃取時間的選擇

固相微萃取的萃取時間與主要揮發性成分在萃取頭涂層分配平衡吸附的時間有關，萃取頭在接近平衡時延長時間無意義，需找尋合適的萃取時間，使得各主要揮發性成分在萃取頭涂層的分配最合適。從圖5可知，隨著萃取時間增長，各主要揮發性成分大致都是增長的趨勢。由于萃取時間短，分子量較大的揮發性成分未大量進入頂空氣體，則分子量較小的物質被萃取頭大量吸附，隨時間延長，分子量較大的物質進入頂空層，主要揮發性成分的總峰面積也隨之增長，再延長時間，導致其他揮發性成分增多，使得主要揮發性成分的總峰面積百分比開始遞減。在20 min后主要揮發性成分的總峰面積開始有所下降（表6）。本著節約時間和能源的原則考慮，20 min的總峰面積較高，且各主要揮發性成分分布均勻較適于其他萃取時間，以20 min作為萃取時間。

2.7 HS-SMPE-GC-MS分析西番蓮的風味成分

采用固相微萃取法，取0.5 mL西番蓮果汁，不加入氯化鈉，使用65?μm的DVB/PDMS萃取頭，在40?℃下萃取20 min的條件下結合GC-MS，得到總離子流圖（圖6）。

通過HS-SPME-GC-MS分析得到西番蓮的揮發性成分62種，種類由多到少分別為酯類29種（71.58%）、醇類11種（12.51%）、醛類8種（3.13%）、酮類6種（5.34%）、烯烴類5種（5.37%）、酸類2種（0.47%）。其中西番蓮揮發成分中酯類物質為主要成分，其次是醇類，酮類、烯烴類雖種類偏少但是也有一定的貢獻。西番蓮中檢測可鑒定的揮發性成分總峰面積為98.40%，質譜成分中14種主要揮發性成分占總峰面積的72.69%。表明此分析方法可以較為全面地表示出西番蓮揮發性成分。

3??討論

利用GC-O-MS結合保留指數確定主要成分的方法，直觀地找到有香味的物質，使得選取條件時更具針對性。焦嬌等^[23]通過使用GC-O-MS確定了紅棗發酵酒中的重要的揮發性成分;苗愛清等^[24]利用GC-O-MS對烏龍茶的香氣成分進行了分析，確定了其主要揮發性成分;何聰聰等^[25]使用SPME結合GC-O-MS對鮮榨西瓜汁揮發性成分進行了分析，確定了西瓜汁中重要揮發性成分。

使用自動進樣，可以在減少樣品使用量的同時避免人為誤差，獲得較穩定的實驗數據，可能是由于有效的攪拌可加速分析物的擴散速度降低靜態水膜的干擾^[26]，所以樣品少量的揮發成分量便足夠被吸附檢測。

韓素芳等^[27]檢測中使用與本研究不同的萃取頭，由于選取指標的不同，且使用不同的色譜柱，從而造成選取差別。本研究中氯化鈉的添加量、溫度變化趨勢與韓素芳等^[27]研究結果一致。由于研究目的不同，本文做了不同選擇。本研究認為，添加氯化鈉后，揮發性成分并未獲得較大差距;而低溫可在節省能源的同時不易發生其他化學變化，萃取時攪拌均勻受熱穩定，低溫已滿足需求。

本研究發現在不同溫度某些主要揮發性成分有不同的萃取效果，在今后的研究中可針對不同的揮發性成分的最適揮發溫度，采用不同溫度測定。隨著科技的發展有望出現固相微萃取溫度可分段式處理，根據所需對萃取溫度進行分段增加溫度的方法，使得不同的揮發性成分能較好地被吸附到萃取頭上，從而實現固相微萃取的更優結果。

此檢測方法能快速、有效地反映西番蓮的真實揮發性成分，優于對主要揮發性成分進行檢測研究，有利于探究不同品種/產地西番蓮之間的香氣區別、其香氣成分在加工中的變化及西番蓮果汁香氣保持的方法等，也可進一步深入研究其香氣與其他化合物之間的聯系。

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