不同溫度下長莖葡萄蕨藻無機碳利用

黃 丹，劉東超，王曉梁，林 挺，黃曉健，歐陽兆攀

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不同溫度下長莖葡萄蕨藻無機碳利用

黃 丹1,2，劉東超1,2，王曉梁1,2，林 挺1，黃曉健1，歐陽兆攀1

（1. 廣東海洋大學水產學院 / 2. 廣東省藻類養殖與應用工程技術研究中心，廣東 湛江 524088）

【】闡明長莖葡萄蕨藻對無機碳的利用方式。運用pH漂移技術，探索藻體質量、藻體部位、照度和海水體積對長莖葡萄蕨藻（）的pH補償點的影響，并研究在3種不同溫度（20、25、30 ℃）下，乙酰唑胺（AZ）、乙氧苯丙噻唑磺胺（EZ）、4,4′-二異硫氰基芪2,2′-二磺酸（DIDS）、釩酸鹽（Van）4種抑制劑對長莖葡萄蕨藻無機碳的利用影響。藻體質量、藻體部位、照度和海水體積對長莖葡萄蕨藻的pH補償點均無顯著性影響（> 0.05），在一定范圍內藻體質量或照度越大，達到pH補償點時間越短，且pH補償點均大于9。20 ℃下各抑制劑的抑制作用最大，其次為30 ℃，25 ℃最小，但3種溫度下各抑制劑的抑制率無顯著差別（> 0.05）。4種抑制劑中DIDS對長莖葡萄蕨藻pH補償點和無機碳利用均無顯著影響（> 0.05），剩余3種抑制劑的抑制作用依次為EZ> AZ >Van。藻體質量、藻體部位、照度和海水體積對長莖葡萄蕨藻pH補償點無影響。溫度對長莖葡萄蕨藻吸收利用無機碳沒有明顯影響。長莖葡萄蕨藻能利用HCO3-作為無機碳源進行光合作用。

長莖葡萄蕨藻；pH補償點；無機碳利用；溫度；抑制劑

長莖葡萄蕨藻（），隸屬蕨藻科（Caulerpaceae），蕨藻屬（），又名“海葡萄”“綠色魚子醬”[1]，是一種高蛋白、高纖維、低脂肪，且富含礦物質的食用綠藻[2-5]。其藻體內含有具較強抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、鎮痛、抗癌和治療痛風、糖尿病、肥胖癥作用的多糖、蕨藻倍半萜、蕨藻紅素等活性物質[6-8]，其干藻粉有吸附銅、鎘、鉛等重金屬和廢水中堿性染料的作用[9-10]，其在生態混合養殖中還可有效去除養殖水體中的氨氮起到凈化水質的作用[11-13]。因此，對長莖葡萄蕨藻的研究具有重要的現實意義和經濟價值。目前，國內外對長莖葡萄蕨藻的研究主要集中在營養成分[2-5]、養殖技術[14-17]、凈化水質[11-13]等方面，但有關長莖葡萄蕨藻無機碳的利用途徑的研究尚未見報道。

開展長莖葡萄蕨藻對無機碳的利用研究是深入認識其光合生理機制和提高養殖產量的基礎。在較高pH（約8.0~8.2）和高鹽度（約35）的天然海水中，溶解的無機碳（DIC）主要以HCO3-為主，約占90%，游離的CO2極少，而CO32-不能直接被利用[18-20]。為了克服低CO2環境的限制，許多大型海藻逐漸形成了利用HCO3-以提高細胞內的CO2濃度的碳濃縮機制（CCM）[19, 21-23]。研究表明，大多數大型海藻能通過以下3種途徑利用HCO3-作為無機碳源進行光合作用：胞外碳酸酐酶（CA）催化的HCO3-利用（此過程可被胞外碳酸酐酶抑制劑AZ所抑制）[24]；通過陰離子交換蛋白直接轉運HCO3-（此過程可被陰離子交換蛋白抑制劑DIDS所抑制）[20, 25]；依賴于質膜P型H+- ATP酶的HCO3-主動運輸（此過程可被膜ATP酶抑制劑Van所抑制）[26-27]。進入細胞內的HCO3-必須在胞質CA或葉綠體CA的作用下轉化成CO2才能參與核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）所催化的光合作用的碳固定反應（此過程可被抑制劑EZ所抑制）[26]。由于HCO3-的利用能被不同的抑制劑所抑制，因此添加抑制劑被廣泛的應用于海藻無機碳利用途徑的研究中。

在封閉系統中測量pH補償點在一定程度上能反映藻類對無機碳的利用。目前眾多學者運用pH漂移技術測定pH補償點的方法來研究藻類對無機碳的利用，但其所用到的藻體質量、海水體積以及照度不一致[19, 24-26, 28-33]，而上述因素是否會影響pH補償點的測定，目前相關報道較少，僅岳國峰等[34]研究了材料用量和照度對煙雜一號海帶（×）幼孢子體pH補償點的影響。同時，長莖葡萄蕨藻藻體由直立枝、匍匐莖以及假根3部分組成，不同的藻體部位是否會影響補償點的測定，尚不清楚。研究表明，不同的藻類對無機碳的利用途徑不同，同一種藻在不同溫度條件下其無機碳利用方式亦不同，且溫度對大型海藻無機碳利用途徑的影響具有較大的種間差異性[19]。

本研究通過分析藻體質量、藻體部位以及照度和海水體積對長莖葡萄蕨藻的pH補償點的影響，研究在不同溫度下利用4種抑制劑對長莖葡萄蕨藻光合作用中無機碳的利用，旨在闡明長莖葡萄蕨藻對無機碳的利用能力及可能的利用方式，以期為長莖葡萄蕨藻養殖過程中外源無機碳的添加提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用長莖葡萄蕨藻購自深圳市藍汀鼎執生物科技有限公司，培養于廣東海洋大學藻類實驗室。培養條件：溫度為（26 ± 1）℃，照度為2 000~5 000 lx，光暗周期為12∶12，連續充氣培養；培養液為添加NaNO30.5 mmol?L-1、KH2PO40.1 mmol?L-1，鹽度為（32 ± 1），pH為7.8~8.2的消毒海水；實驗前挑選健康的、表面無雜藻的藻體，用消毒海水沖洗3遍，再用滅菌的解剖剪剪下一定數量的直立枝和匍匐莖暫養恢復一天，選擇暫養后情況較好的藻體進行實驗。

1.2 藻體質量、藻體部位、照度以及海水體積對pH補償點的影響

利用pH漂移技術測定pH補償點，按照表1實驗設計將不同質量、部位的長莖葡萄蕨藻藻體置于50 mL透明玻璃小瓶中，用瓶蓋密封，放于25 ℃光照培養箱連續光照培養，每組設置3個重復。每隔2 h采用pH計測定pH，pH計使用前用pH校正液校準，pH增加不超過0.01時停止測定，此時的pH值為藻體在該條件下的pH補償點，這段時間內pH的變化曲線稱為pH漂移曲線[35]。B組為對照組，A、C、D、E組分別研究海水體積、藻體部位、藻體質量、照度對pH補償點的影響。

表1 藻體質量、藻體部位、照度以及海水體積對pH補償點影響實驗設計

1.3 不同溫度下抑制劑對長莖葡萄蕨藻無機碳利用的影響

稱取長莖葡萄蕨藻直立枝約1.0 g（鮮重FW）置于含200 mL消毒海水的250 mL錐形瓶中，分別加入胞外碳酸酐酶抑制劑——乙酰唑胺（AZ）、胞外和胞內碳酸酐酶抑制劑——乙氧苯丙噻唑磺胺（EZ）（AZ、EZ均用 0.05 mol?L-1NaOH溶液配制成 20 mmol?L-1的原液）、陰離子交換蛋白抑制劑——4,4′-二異硫氰基芪2,2′-二磺酸（DIDS）、ATP酶抑制劑——釩酸鹽（原釩酸鈉，Van），參照王吉等[26]研究確定AZ、EZ、Van 3種抑制劑的最終濃度分別為100、100、500 μmol?L-1，參照程苗等[25]研究確定抑制劑DIDS的最終濃度為300 μmol?L-1。最后用0.1 mol?L-1NaOH溶液或0.1 mol?L-1HCl溶液將各組溶液pH調成與未加抑制劑的對照組一致，封口膜密封。每組設置3個平行，分別置于溫度為20、25、30 ℃，照度為2 000 lx的光照培養箱中持續光照培養。抑制劑AZ、EZ、DIDS均購自Sigma公司，抑制劑Van購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 總堿度測定及無機碳濃度、無機碳利用量抑制率的計算

每隔3 h測定pH，pH增加不超過0.01時停止測定，并在測定pH后取20 mL培養液測定總堿度，總堿度測定5次。采用 pH 法（GB/T 12763.4— 2007）測定總堿度（TA）。根據pH、溫度、鹽度和總堿度值，使用由MILLERO等[36]確定的碳酸解離常數和DICKSON[37]發表的HSO4-解離常數，運用CO2SYS 軟件[38]計算無機碳（DIC）濃度。并計算12 h內無機碳利用量以及抑制劑對無機碳利用量的抑制率[39]。

抑制率=（對照組DIC的利用量-抑制劑組DIC的利用量）/ 對照組DIC的利用量。

1.5 統計分析

所得測定結果均表示為平均值± 標準差（≥ 3）。用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著者利用Tukey進行多重比較，以< 0.05作為差異的顯著性水平。用GraphPad Prism 7.00軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 藻體質量、藻體部位、照度以及海水體積對pH補償點的影響

由表1、2可知5個處理組最終在不同的時間內均達到了基本相同的pH補償點，且均大于9。A、C、D、E組分別與B組比較得到海水體積、藻體部位、藻體質量、照度均對pH補償點無顯著性影響（> 0.05）。D組藻質量0.8 g，達到pH補償點的時間為26 h，E組照度為4 000 lx達到pH補償點的時間為28 h，而B組藻質量0.4 g、照度2 000 lx則需要30 h，表明在一定范圍內藻體質量越大或照度越強，達到pH補償點時間越短。A、C兩組與B組達到pH補償點的時間一致，表明海水體積與藻體部位對達到pH補償點的時間無影響。

表2 藻體質量、藻體部位、照度以及海水體積對pH補償點的影響

注：同一列中字母不同表示差異存在統計學意義（< 0.05）

Note：The difference of letters in the same column was statistically significant （< 0.05）

圖1 長莖葡萄蕨藻不同處理組的pH漂移曲線

2.2 不同溫度下抑制劑對長莖葡萄蕨藻無機碳利用的影響

2.2.1 不同溫度下抑制劑對長莖葡萄蕨藻培養體系pH的影響 從圖2 a-c可見，除了30 ℃添加Van組在30 h后pH降低，其余處理組在20、25、30 ℃持續光照的密閉條件下pH變化趨勢大體一致，30 h基本達到平緩，直至達到pH補償點。較其它組而言，對照組pH值上升速度最快，pH補償點最高，在20、25、30 ℃的pH補償點分別為9.02、9.27、9.06。DIDS處理組的pH補償點在20、25、30 ℃下分別為8.99、9.26、9.02，比對照組低（> 0.05）。其次為添加Van組，在20、25、30 ℃下pH補償點分別為8.66、8.86、8.52，顯著低于對照組和DIDS處理組（< 0.05）。由于30 ℃添加Van組30 h后有部分藻體腐爛，因此出現pH下降趨勢。除了30 ℃下Van處理組與AZ處理組的pH補償點無顯著差異（> 0.05），其余溫度下Van處理組的pH補償點明顯高于AZ和EZ處理組（< 0.05）。其中EZ處理組的pH值上升最少，pH補償點最低，分別為8.26（20 ℃）、8.46（25 ℃）、8.37（30 ℃），并明顯低于AZ處理組的pH補償點8.54（20、30 ℃）、8.78（25 ℃）（< 0.05）?？梢姡珼IDS基本無抑制作用，AZ、EZ、Van分別有不同程度的抑制作用，其中EZ抑制效果最明顯，AZ次之，Van最差。

3個溫度中25 ℃培養條件下各組的pH補償點最高，并顯著高于20 ℃和30 ℃的pH補償點（< 0.05）。除了20 ℃Van處理組的pH補償點顯著高于30 ℃外（< 0.05），其余各組均低于30 ℃，除了EZ處理組有顯著差異外（< 0.05），剩下的3組均無顯著差異（> 0.05）（圖2-d）。

2.2.2 不同溫度下抑制劑對長莖葡萄蕨藻培養體系無機碳DIC的影響 連續光照培養下，隨著長莖葡萄蕨藻光合作用的進行，密閉系統中無機碳濃度逐漸降低。不同溫度和不同抑制劑處理對長莖葡萄蕨藻DIC吸收的影響不同，但在不同溫度下大體變化趨勢一致（圖3 a-c），并且在前6 h無機碳吸收利用的較多。未添加抑制劑的對照組DIC降低最快，吸收利用無機碳的能力最強。其次為添加DIDS組，添加AZ組雖較添加Van組的DIC濃度高，但二者均比EZ組低，EZ 是4種抑制劑中對長莖葡萄蕨藻無機碳吸收抑制效果最強的。5組利用無機碳的能力從大到小依次為對照組> DIDS > Van > AZ > EZ。

從圖3-d可見，培養6 h后長莖葡萄蕨藻在25 ℃對DIC的吸收利用量最大，對照組、AZ、EZ、Van、DIDS處理組的無機碳利用量分別為370.93、180.07、126.74、245.07、362.74 μmol?kg-1。降低（20 ℃）或升高溫度（30 ℃）條件下，長莖葡萄蕨藻的DIC利用量均有所下降，且30 ℃下DIC利用量下降更多，但20、30與25 ℃的DIC利用量無顯著差異（> 0.05）。

a、b、c表示20、25、30 ℃；d：pH補償點；不同的大寫字母表示相同溫度下不同處理間具有顯著性差異（P < 0.05）；不同的小寫字母表示不同溫度下相同處理之間具有顯著性差異（P < 0.05）

a、b、c表示20、25、30 ℃；d：長莖葡萄蕨藻培養6 h后DIC的利用量；不同的大寫字母表示相同溫度下不同處理間具有顯著性差異（P < 0.05）；不同的小寫字母表示不同溫度下相同處理之間具有顯著性差異（P < 0.05）

2.2.3 不同溫度下抑制劑對長莖葡萄蕨藻無機碳利用抑制率的影響 在3種溫度條件下培養6 h后，DIDS的抑制率分別為0.51%（20 ℃）、2.21%（25 ℃）、0.72% （30 ℃），基本上認為無抑制作用，說明長莖葡萄蕨藻不能通過陰離子交換蛋白機制直接吸收海水中的HCO3-。由圖4可知，胞外碳酸酐酶抑制劑AZ、胞內胞外碳酸酐酶抑制劑EZ和ATP酶抑制劑Van對長莖葡萄蕨藻無機碳的利用具有不同程度的抑制作用，抑制率分別為62.13%、 72.85%和41.19% （20 ℃），51.45%、65.83%和33.93% （25 ℃），55.95%、68.92%和49.81% （30 ℃），抑制作用從大到小依次為：EZ>AZ >Van。但3種溫度下，AZ和EZ的抑制作用無顯著差異（> 0.05），除30 ℃外均與Van有顯著性差異（< 0.05）。

不同的大寫表示相同溫度下不同處理之間具有顯著性差異（P < 0.05）；小寫字母表示不同溫度下相同處理之間具有顯著性差異（P < 0.05）

在3種實驗溫度下，20 ℃時各抑制劑的抑制作用最大，其次為30 ℃，25 ℃最小，但此3種溫度下各抑制劑的抑制率均無顯著差別（> 0.05），說明3種溫度對長莖葡萄蕨藻吸收利用無機碳沒有明顯影響，但20 ℃和30 ℃抑制作用都比25 ℃大，說明25 ℃是較適宜長莖葡萄蕨藻生長和進行光合作用的溫度，且溫度變化并不改變長莖葡萄蕨藻利用HCO3-的方式。

3 討論

3.1 藻體質量、藻體部位、照度以及海水體積對pH補償點的影響

海水體積、藻體部位、藻體質量、照度均對pH補償點無顯著性影響（> 0.05），但藻體質量和照度會影響達到pH補償點的時間，在一定范圍內藻體質量越大或照度越強，達到pH補償點時間越短。所以，可以通過適當增加藻體質量或提高照度來縮短達到pH補償點的時間。本實驗結果與岳國峰等[34]的研究結論一致。長莖葡萄蕨藻的直立枝與匍匐莖作為實驗材料均對pH補償點的測定無影響，因此可考慮將生長較快的匍匐莖作為后續實驗材料。

3.2 長莖葡萄蕨藻無機碳的利用

在封閉系統中，海藻消耗溶解的DIC導致水體pH上升，測量pH補償點在一定程度上能反映藻類對無機碳的利用。研究表明，可利用HCO3-進行光合作用的藻類pH補償點一般都大于9.0[19, 30, 35]。在pH為9左右時，只以CO2為碳源的藻類無法通過利用 HCO3-來進一步提高pH值，相反如果藻類能夠利用HCO3-，pH補償點可以達到相當高的值[40]。在實驗的3種溫度下（20、25、30 ℃），未添加抑制劑的長莖葡萄蕨藻pH補償點均大于9，表明長莖葡萄蕨藻能利用HCO3-進行光合作用。

在實驗3種溫度條件下，DIDS對長莖葡萄蕨藻pH補償點和無機碳利用均無顯著影響（> 0.05），表明長莖葡萄蕨藻不能通過陰離子交換蛋白直接吸收海水中的HCO3-。CARLBERG等[41]研究發現刺松藻（）也不能通過陰離子交換蛋白機制直接吸收海水中的HCO3-。這可能與長莖葡萄蕨藻和刺松藻在細胞結構上的類似有關，二者均沒有形成這種HCO3-的利用機制，而腸滸苔 () 等多數綠藻一般具有能被DIDS抑制的高pH誘導的直接吸收海水中的HCO3-的光合作用的特征[42-43]。大型綠藻HCO3-直接吸收機制與環境條件有關，在高光強、高pH及富營養的海水條件下或在AZ存在下生長的藻類可誘導出陰離子交換蛋白協助的HCO3-直接吸收（即DIDS敏感機制的HCO3-吸收）[27, 42]。因此，對于長莖葡萄蕨藻在其它條件下是否存在陰離子交換蛋白協助的HCO3-直接吸收途徑有待進一步研究。

在不同溫度條件下，3種抑制劑的抑制效果強弱為EZ＞AZ＞Van，說明長莖葡萄蕨藻可以通過胞外CA間接利用HCO3-。此途徑也是絕大多數大型海藻如綠藻中的石莼（）[44]、緣管滸苔（）[19]和滸苔（）[28]以及腸滸苔（）[42]，紅藻中的壇紫菜（）[24]、菊花心江蘺（)[45]、龍須菜（）[46]、舌狀蜈蚣藻（）[32]及褐藻裙帶菜（）[31]、宣藻（）[26]、海黍子（Yendo）[25]、羊棲菜（）[47]等利用無機碳的最普遍和最基本的方式。此外，長莖葡萄蕨藻還存在依賴ATP酶主動轉運HCO3-的利用途徑。綠藻中的剛毛藻（）[48]、褐藻中的萱藻絲狀體[26]以及掌狀海帶（）和糖海帶（）[27]也發現此HCO3-利用途徑，但其具體機制還有待進一步研究。EZ和AZ的抑制作用統計學上無顯著差異（> 0.05），此研究結果與程苗等[25]對海黍子的研究結果一致。造成這一結果的原因可能是EZ抑制胞外CA活性導致進入細胞內部的無機碳減少，使得EZ對胞外CA的抑制效果遮蓋了其對胞內CA的抑制效果[25]。綜上，長莖葡萄蕨藻能利用HCO3-作為無機碳源進行光合作用，且對HCO3-的利用方式有兩種：1）通過胞外碳酸酐酶（CA）催化HCO3-水解為CO2，CO2擴散進入細胞的間接吸收利用方式；2）依賴細胞膜上ATP酶主動轉運HCO3-，再由胞內CA水解為CO2的直接利用途徑。由于Van的抑制效果最差，長莖葡萄蕨藻主要以方式1）利用HCO3-。

在3種實驗溫度條件下，20 ℃下各抑制劑的抑制作用最大，其次為30 ℃，25 ℃最小，但3者抑制率無顯著差別（> 0.05），這表明溫度對長莖葡萄蕨藻吸收利用無機碳沒有明顯影響，但低溫或高溫均會降低長莖葡萄蕨藻對無機碳的吸收利用。25 ℃是較適宜長莖葡萄蕨藻生長和進行光合作用的溫度，溫度變化并沒有改變長莖葡萄蕨藻利用HCO3-的方式。徐軍田等[19]研究溫度（5、10、15、20、25 和 30℃）對兩種滸苔無機碳利用機制的影響，得出兩種滸苔在不同溫度下無機碳的轉運方式不同，且存在著明顯的種間差異，但滸苔在溫度為10~30 ℃時無機碳利用方式相同。本研究結果與其相似，這可能是因為溫度變化對參與長莖葡萄蕨藻光合作用過程的各種酶活性影響不大，因此在20~30 ℃長莖葡萄蕨藻的無機碳利用方式相同。

4 結論

海水體積、藻體部位、藻體質量和照度均對長莖葡萄蕨藻的pH補償點無影響，但藻體質量和照度會影響達到pH補償點的時間，在一定范圍內藻體質量越大或照度越強，達到pH補償點時間越短。長莖葡萄蕨藻除了可以利用海水中的游離CO2外，還能利用HCO3-作為無機碳源進行光合作用。溫度（20~30 ℃）對長莖葡萄蕨藻吸收利用無機碳沒有明顯影響，且3種溫度下長莖葡萄蕨藻無機碳的利用方式相同。

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Utilization of Inorganic Carbon ofunder Different Temperature

HUANG Dan1,2, LIU Dong-chao1,2, WANG Xiao-liang1,2, LIN Ting1, HUANG Xiao-jian1, OUYANG Zhao-pan1

（1./ 2.,524088,）

【】To evaluate the utilization of inorganic carbon by.【】The effects of algal weight, algal body parts, irradiance and seawater volume on pH compensation point were explored by using the pH drift technology, and the effects of four inhibitors acetazolamide（AZ）, 6-ethoxyzolamide（EZ）, 4,4'-diisothiocyano- stilbene-2,2'-disulfonate（DIDS）, vanadate（Van）on the utilization of inorganic carbon inunder three different temperatures （20 , 25, 30 ℃）were analyzed.【】The results showed that algae weight, algal body parts, irradiance, and seawater volume had no significant effect on the pH compensation points（> 0.05）. The greater the weight of the algae or the greater the irradiance within a certain range, the shorter the time required to reach the pH compensation point which is greater than the pH compensation point 9. The inhibitory effect of each inhibitor was highest at 20 ℃, followed by 30 ℃ and 25 ℃, but there was no significant difference between the inhibitors at different temperatures（> 0.05）. Among the four inhibitors, DIDS had no significant effect on the pH compensation point and inorganic carbon utilization of（> 0.05）, and the inhibition effects of the remaining three inhibitors were as follows: EZ>AZ>Van.【】The algae weight, algal body parts, irradiance, and seawater volume had no effect on the pH compensation point of.The temperature had no significant effect on the utilization of inorganic carbon by, and HCO3-can be used as an inorganic carbon source for photosynthesis by.

; pH compensation point; inorganic carbon utilization; temperature; inhibitors

S968.4

A

1673-9159（2019）03-0061-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.009

2019-2-12

廣東省科技計劃項目（2015A020209167）

黃丹（1991—），女，碩士研究生，主要從事藻類生理生態學研究。E-mail: gdouhd@163.com

劉東超（1963—），男，副教授，主要從事藻類生理生態學研究。E-mail: liudc@gdou.edu.cn

黃丹，劉東超，王曉梁，等. 不同溫度下長莖葡萄蕨藻無機碳利用[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（3）：61-69.

（責任編輯：劉朏）