牡蠣酶解工藝優化及其酶解產物對小鼠睪酮分泌的影響

張雪妍，秦小明,2,3,4，高加龍,2,3,4，林海生,2,3,4，章超樺,2,3,4，黃艷球

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牡蠣酶解工藝優化及其酶解產物對小鼠睪酮分泌的影響

張雪妍1，秦小明1,2,3,4，高加龍1,2,3,4，林海生1,2,3,4，章超樺1,2,3,4，黃艷球1

（1. 廣東海洋大學食品科技學院 / 2. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室室/ 3. 廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室/ 4. 國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東 湛江 524088）

【】優化太平洋牡蠣（）酶解工藝條件，并研究酶解產物及其超濾組分對體外培養的睪丸間質細胞增殖及睪酮分泌的影響。以多肽得率為參考標準，對木瓜蛋白酶酶解牡蠣的加酶量、初始pH、酶解時間、酶解溫度進行單因素及正交實驗優化；通過MTT法及酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測不同濃度牡蠣酶解產物及其超濾組分對TM3小鼠睪丸間質細胞增殖及睪酮分泌的影響。木瓜蛋白酶最佳酶解條件為加酶量3 000 U/g，初始pH 6. 5，酶解溫度62.5 ℃，酶解時間4.5 h，在此條件下其多肽質量濃度為14.95 mg/mL；牡蠣酶解液及其超濾組分在 0.25~1.00 mg/mL質量濃度范圍內，與空白對照組相比，能夠顯著增加TM3細胞的增殖活性（＜0.05），且具有濃度依賴性和時間依賴性。其中，< 5 ku 和5~10 ku超濾組分細胞增殖活性及促進睪酮分泌活性均最強。牡蠣酶解產物及其超濾組分可有效增強小鼠睪丸間質細胞增殖活性并促進其分泌睪酮。

牡蠣；酶解產物；小鼠睪丸間質細胞；增殖活性；睪酮

男性的雄激素主要由睪丸間質細胞分泌[1]，而睪酮作為最主要的雄激素，可以通過劑量依賴的方式促進精子的產生，并改善肌肉質量和增強體力，在維持男性健康方面發揮著重要作用[2-4]。但是睪丸間質細胞的數量會隨著年齡的增長而減少，睪酮分泌量也隨之減少，從而導致肌肉萎縮及骨質疏松等疾病發生[5]。最近研究表明，人工合成品睪酮替代物可以起到類睪酮作用，能夠改善老年男性的肌肉量減少和骨質減少等癥狀[6-7]。

太平洋牡蠣（），也稱長牡蠣，俗稱生蠔、海蠣子等，是一種廣溫、廣鹽的內灣雙殼貝類[8]。20世紀80年代初從日本引入我國，由于該品種產量高、適應性強、生長速度快、形態肥滿等優點，在我國北方大面積養殖[9]，已逐步成為我國乃至全球牡蠣養殖的首選品種。太平洋牡蠣隸屬于瓣鰓綱（lammelibranchia）牡蠣目（Osteroida）牡蠣科（Ostreidae）巨蠣屬（）[10]，肉質鮮美，含有豐富糖原、蛋白質、氨基酸、?；撬帷⒅舅?、維生素和無機鹽[11]，因其營養價值極高，被冠以“海洋牛奶”“根之源”之美稱[12]。牡蠣已被我國衛生部批準為藥食兩用材料[13]。牡蠣還具有廣泛的生理活性，其提取物具有增強機體免疫[14]、抗氧化[15]、抗疲勞[16]、抗菌[17]、降血糖[18]、降血壓[19]、醒酒護肝[20]等多種生物活性，此外有增強男性性功能的潛在藥用價值[21]。研究表明，小分子牡蠣多肽可增加小鼠血清中膽固醇和性激素含量，提高小鼠的交配能力、性腺器官重量和臟器系數以及精子質量[22]。羅齊軍等[23]研究發現，補充牡蠣多肽可以使大鼠血睪酮含量增加，從而改善長期大負荷訓練導致的低血睪酮。上述研究均只證明了牡蠣提取物在動物實驗中對大鼠或小鼠睪酮分泌有促進作用，但相關細胞實驗及其分子機制目前尚未有研究報道。

本研究以太平洋牡蠣為原料，以多肽得率為指標對牡蠣的酶解工藝條件進行優化，利用體外促進小鼠睪酮分泌評價進行活性追蹤，通過酶解、超濾等手段對活性成分進行有效富集，探究牡蠣酶解產物及其超濾組分對TM3雄性小鼠睪丸間質細胞增殖及分泌睪酮的影響，為研發促進男性睪酮分泌及生殖健康保健功能食品提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮太平洋牡蠣購于日本東京筑地市場（牡蠣酶解工藝優化及樣品制備均在日本東京海洋大學實驗室完成），木瓜蛋白酶（酶活力5×104U/g）購于廣西南寧龐博生物有限公司，DMED/F12 培養基購自Gibco公司，馬血清、青/鏈霉素雙抗購自HyClone公司，噻唑蘭（MTT）購自Genview公司，小鼠睪酮ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，小鼠睪丸間質細胞（TM3）購于上海中科院細胞庫。

1.2 儀器與設備

7780型高速落地冷凍離心機購自日本久保田商事株式會社，UV-1800型蛋白微量測定用分光光度計購自日本東京島津科學株式會社，F-52型精密pH計購自日本帝國理化株式會社，FDU-2000型真空冷凍干燥儀購自東京理化器械株式會社，超濾裝置及其超濾膜購自美國Milipore 公司，CKX41型倒置顯微鏡購自日本Olympus，SW-CJ-2FD型超凈工作臺購自蘇州凈化有限公司，Forma 370型CO2恒溫箱、Multiskan FC型酶標儀購自美國Thermo公司，5810R型高速臺式冷凍離心機購自德國Eppendorf 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 木瓜蛋白酶酶解牡蠣單因素條件選擇 選用木瓜蛋白酶[24]，以多肽得率為指標，考察不同加酶量(1 000、2 000、3 000、5 000、7 000 U/g)、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、酶解溫度（50、55、60、65、70 ℃）、酶解時間（2、3、4、5、6 h）對多肽得率的影響。

1.3.2 正交實驗設計 根據前期單因素實驗結果，以加酶量、pH、酶解溫度、酶解時間4個因素進行L9（34）正交實驗設計，優化酶解條件。通過直觀分析，得到最佳酶解條件。正交實驗設計因素水平參見表1。

表1 正交設計因素水平

1.3.3 多肽含量的測定 根據魯偉等[25]蛋白水解液中多肽含量的測定方法，基于三氯乙酸在酸性條件下與蛋白質形成不溶性鹽而凝聚沉淀的原理，通過雙縮脲法測定經三氯乙酸沉淀后上清液在540 nm下光密度值，對照牛血清蛋白標準曲線（= 0.052 4- 0.000 4，2 = 0.999 6），得樣品溶液中多肽濃度。

1.3.4 牡蠣酶解產物的制備流程 取新鮮牡蠣肉，經洗凈、瀝干，然后按料水質量體積比1∶3（g/mL）比例[26]加入預冷的蒸餾水，高速勻漿，加入木瓜蛋白酶，以正交實驗得到的優化條件酶解牡蠣，酶解液沸水浴滅活10 min，冷卻至室溫，最后以8 000 r/min 離心20 min取上清液，部分留作下一步超濾分級，部分濃縮后冷凍干燥備用。

1.3.5 超濾分級 利用超濾攪拌裝置及5、10 ku超濾膜對酶解液進行分級處理，進口壓力控制在344.7 kPa，得到<5、5~10和>10 ku 3個超濾組分，收集各個組分，冷凍干燥備用。

1.3.6 MTT法檢測牡蠣酶解產物及其超濾組分對TM3細胞體外增殖的影響 TM3細胞在D-MEM/F-12培養基（體積分數92.5%）中培養，該培養基補充有體積分數5%馬血清和體積分數2.5%優質胎牛血清，37 ℃細胞培養箱中培養（體積分數5% CO2，濕度95%）。在96孔培養板上每孔加6 000個細胞進行種板，培養12 h后，將細胞用不同質量濃度（0、0.125、 0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）的酶解產物及其超濾組分（<5、5~10和>10 ku)）進行處理，并分別培養12和24 h。培養結束后，用磷酸緩沖液PBS配置5g/L MTT溶液，每孔加入20 μL MTT溶液，并在培養板溫育4 h。小心吸走上清液，向每孔中加入100 μL DMSO，然后搖動10 min。用酶標儀在570 nm處測量上清液的光密度值[27]。

1.3.7 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測睪酮含量 TM3細胞經不同質量濃度（0.25、0.50、1.00 mg/mL）牡蠣酶解產物及其超濾組分（<5、5~10和>10 ku）干預24 h，收集細胞培養上清液，3 000 r/min離心20 min取上清液，根據小鼠ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測細胞培養液中睪酮含量。

1.4 統計分析

采用Excel 2016、Origin 2017、SPSS 19.0對數據進行分析處理，用LSD多重比較進行差異顯著性分析（= 0.05）。

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解條件的確定

2.1.1 加酶量對酶解效果的影響 在pH 6.5，酶解溫度60.0 ℃，酶解 5.0 h的條件下，考察不同加酶量對多肽得率的影響，如圖 1 所示。多肽濃度隨著加酶量的增加而逐漸上升，當加酶量超過 3 000 U/g后，多肽濃度無顯著性變化（> 0.05）。這是因為酶解初始階段底物和蛋白酶濃度較大，酶解速度較快；隨著反應的進行，底物濃度逐漸減小，酶活力不斷下降，酶解液中蛋白與酶的接觸面積減少，酶解速度降低[28]。因此在加酶量超過3 000 U/g后，多肽得率不會隨著加酶量的增加而增加，反而由于肽段開始被分解而出現多肽濃度緩慢降低的情況。為避免水解過度導致不必要的肽損失及節約成本等考慮，選取加酶量為3 000 U/g。

2.1.2 初始pH對酶解效果的影響 在加酶量3 000 U/g，酶解溫度60.0 ℃，酶解5.0 h的條件下，考察不同初始pH對多肽得率的影響，如圖 2 所示，pH 6.5 時，多肽濃度最高，且與pH 5.0、5.5和7.0具有顯著差異（< 0.05）。由于牡蠣勻漿在添加木瓜蛋白酶后，初始pH值更接近于pH 6.5，且木瓜蛋白酶在pH 6.5時對牡蠣具有理想的酶解效果[24]，故選擇6.5為初始pH。

凡有一個相同標記字母即為差異不具統計學意義（P > 0.05）

凡有一個相同標記字母即為差異不具統計學意義（P > 0.05）

2.1.3 酶解溫度對酶解效果的影響 在pH 6.5，加酶量3 000 U/g，酶解 5.0 h的條件下，不同酶解溫度對多肽得率的影響如圖 3 所示。隨著溫度的升高，多肽濃度呈現先上升后下降趨勢，在60 ℃時達到最大值，超過此溫度后多肽濃度顯著降低（< 0.05），這是由于蛋白酶在高溫條件下會變性失活，失去其切斷肽鏈的作用。由于高溫條件對樣品生物活性和木瓜蛋白酶酶活力的不利影響，選用 60 ℃作為酶解溫度。周燕芳等[29]在通過單因素實驗優化木瓜蛋白酶酶解海產小雜魚時，其肽回收率和水解度在酶解溫度60 ℃時均最高，酶解效果最好，該結果與本實驗結果一致，說明木瓜蛋白酶在60 ℃時酶解活性最強。

2.1.4 酶解時間對酶解效果的影響 在pH 6.5，加酶量3 000 U/g，酶解溫度60 ℃，考察不同酶解時間對多肽得率的影響，如圖 4 所示。多肽濃度呈現先上升后下降趨勢，多肽濃度在酶解時間4.0~6.0 h間，多肽濃度無顯著性變化（> 0.05），是由于酶解初始階段底物濃度和蛋白酶濃度較大，酶解速度快；隨著反應進行，底物濃度減小，酶活力下降，酶解速度降低。因此為了避免水解過度導致肽損失及節約時間成本考慮，選取酶解時間4.0 h為宜。

凡有一個相同標記字母即為差異不具統計學意義（P > 0.05）

凡有一個相同標記字母即為差異不具統計學意義（P > 0.05）

2.1.5 正交實驗結果 由表2所示，根據正交實驗結果極差值可確定各個因素影響酶解效果的主次關系，即：加酶量＞pH＞酶解時間＞酶解溫度。根據正交實驗結果值可得出最佳酶解條件為2232,即加酶量3 000 U/g，pH 6.5，酶解溫度62.5 ℃，酶解時間 4.5 h，在此條件下，牡蠣酶解液多肽含量最高。經實驗驗證，此條件下酶解得到的多肽質量濃度為 14.95 mg/mL。

2.2 牡蠣酶解產物及其超濾組分對TM3細胞體外增殖的影響

TM3細胞經不同質量濃度（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）的牡蠣酶解產物及其超濾組分（<5、5~10和>10 ku）干預12 h及24 h后，細胞活性如圖5、6所示。如圖5所示，在12 h作用時間內，隨著牡蠣酶解產物及其超濾組分的作用濃度逐漸增加，TM3細胞的細胞活性也逐漸增強，與空白對照組相比，除牡蠣酶解產物在質量濃度0.125 mg/mL的組分外，其余組分細胞活性均顯著增強（＜0.05），且牡蠣酶解產物及其超濾組分四個組分增強細胞活性均表現為濃度依賴性（＜0.05）。如圖6所示，在24 h作用時間內，酶解產物及其超濾組分對TM3細胞的細胞活性隨著樣品濃度的增加，呈先增強后減弱的趨勢，這是由于隨著作用于細胞的樣品濃度增高，時間增長，樣品對于細胞的作用會從促進逐漸轉為抑制。但各質量濃度組分（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）相較于空白對照組，細胞活性均顯著增強（＜0.05）。說明酶產物及其超濾組分對TM3細胞具有細胞增殖活性，除＞10 k超濾組分在1 mg/mL質量濃度下對TM3細胞增殖活性最強，其余組分的最佳作用質量濃度均為0.500 mg/mL。KIM等[22]研究了海馬酶解產物對小鼠睪丸間質細胞增殖的影響，海馬酶解產物在0.2、0.5和1.0 mg/mL質量濃度下作用于TM3細胞24 h 后，均顯著增強了細胞活力，且其最佳作用濃度在0.5~1.0 mg/mL之間。該結果與本實驗結果相似，說明水產品蛋白酶解產物的生物活性物質質量濃度在0.5~1.0 mg/mL區間對睪丸間質細胞均具有較好的增殖活性。與海馬酶解產物相比，在0.5 和1.0 mg/mL 質量濃度作用下，牡蠣酶解產物促進TM3 增殖活性的效果優于海馬酶解產物。

表2 牡蠣酶解工藝優化L9 (34)正交試驗直觀分析

同組別不同樣品濃度間凡有一個相同標記字母即為差異不具統計學意義（P > 0.05）

同組別不同樣品濃度間凡有一個相同標記字母即為差異不具統計學意義（P > 0.05）

12 h與24 h細胞活性相比較，在0.125~1.000 mg/mL質量濃度范圍內，不同組分的24 h細胞活性在相同濃度下均高于其12 h細胞活性（＜0.05），說明牡蠣酶解產物及其超濾組分對TM3細胞增殖活性具有時間依賴性。比較12 h及24 h不同組分的細胞活性增殖情況，超濾組分（<5、5~10和>10 ku）的細胞增殖活性明顯強于牡蠣酶解產物組（＜0.05），說明經過超濾分級，促進TM3細胞增殖的有效活性成分得到了富集。

在12 h作用范圍內，>10 ku超濾組分對TM3細胞增殖活性最顯著，且具有顯著的濃度差異（＜0.05）。到24 h作用后，<5、5~10 ku超濾組分的增殖效果更明顯，且最佳有效作用質量濃度（0.500 mg/mL）較>10 ku組分（1.000 mg/mL）更低。綜合分析，>10 ku組分只是培養前期促進細胞增殖速度較快，24 h作用后增殖效果不及<5、5~10 ku 超濾組分（＜0.05），故<5、5~10 ku 超濾組分對TM3細胞增殖活性最強。

2.3 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測睪酮含量

根據MTT法測得作用24 h細胞活性試驗結果，經顯著性差異分析，得出0.25、0.50、1.00 mg/mL 3個質量濃度作用下TM3細胞的細胞增殖活性顯著高于其他質量濃度（＜0.05），故將這3個濃度的牡蠣酶解產物作用于TM3細胞24 h后，測TM3細胞分泌睪酮含量，經酶聯免疫吸附實驗（ELISA）得出結果如圖7所示。與空白對照組相比，＜5 ku和5~10 ku超濾組分在0.25、0.50 和1.00 mg/mL質量濃度條件下，睪酮分泌均顯著高于空白對照組（＜0.05），且具有濃度依賴性（＜0.05），說明＜5 ku和5~10 ku超濾組分可以有效促進TM3細胞分泌睪酮。＞10 ku超濾組分及牡蠣酶解產物組雖在0.25、1.00 mg/mL條件下與空白對照無顯著性差異（> 0.05），但在0.50 mg/mL條件下，睪酮含量顯著高于空白對照組（＜0.05）。說明牡蠣酶解液及＞10 ku超濾組分在0.50 mg/mL條件下，能有效促進TM3細胞分泌睪酮。3個組分相比較，<5 ku和5~10 ku 超濾組分對促進TM3細胞分泌睪酮活性較強。

KIM等[27]研究海馬酶解產物對小鼠睪丸間質細胞睪酮分泌的影響，發現海馬酶解產物對促進小鼠間質細胞分泌睪酮具有濃度依賴性，說明海洋資源中潛在的生物活性物質可以通過酶法水解得到釋放，通過酶解海洋生物制備活性物質具有較高的研究意義。相關動物實驗研究[22]已表明牡蠣酶解產物可顯著提高小鼠血清睪酮水平，而本研究通過對TM3細胞體外培養，測定牡蠣酶解產物對TM3細胞作用下對其分泌睪酮的影響，對牡蠣酶解產物提高小鼠血清睪酮水平提供了機制的初步探究和實驗支持，因此牡蠣酶解產物提高小鼠血清睪酮水平可能是通過作用于小鼠睪丸間質細胞，促進其增殖及睪酮分泌而來實現其功能作用。

同組別不同樣品濃度間凡有一個相同標記字母即為差異不具統計學意義（P > 0.05）

4 結論

1）通過單因素實驗及正交試驗分析，確定木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為加酶量3 000 U/g、pH 6.5、酶解溫度62.5 ℃、酶解時間 4.5 h，在此條件下太平洋牡蠣酶解得到的多肽質量濃度為14.95 mg/mL。

2）牡蠣酶解液及其超濾組分在0.25 ~ 1.00 mg/mL 質量濃度范圍內，能夠顯著增加TM3細胞的增殖活性，且具有濃度依賴性和時間依賴性；牡蠣酶解液及其超濾組分能夠顯著提高TM3細胞分泌睪酮，尤其是＜5 ku和5~10 ku兩個超濾組分。因此牡蠣酶解液及其超濾組分能有效增強TM3細胞增殖活性并促進其分泌睪酮。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis fromand Effects of Its Enzymatic Hydrolysate on TM3 Leydig Cells

ZHANG Xue-yan1,QIN Xiao-ming1,2,3,4, GAO Jia-long1,2,3,4, LIN Hai-sheng1,2,3,4,ZHANG Chao-hua1,2,3,4, HUANG Yan-qiu1

（1.,/ 2./ 3./ 4.,524088,）

【】To optimize the enzymolysis process conditions ofand explore the effects of enzymatic hydrolysate and its ultrafiltration fractions on cell proliferation and testosterone secretion in the TM3 leydig cells.【】Based on the peptide yield, the single factor optimization and orthogonal experiments were carried out to get the best amount of enzyme, initial pH, temperature and time of enzymatic hydrolysis for papain to hydrolyze oysters. The MTT assay and ELISA kit were used to detect the effects of the proliferation and secretion of testosterone in the TM3 cells, which were treated by different concentrations of oyster hydrolysate and its ultrafiltration fractions.【】The optimal enzymatic hydrolysis conditions for papain are as follows: enzyme addition 3 000 U/g, initial pH 6.5, temperature 62.5 ℃, and time 4.5 h. Its peptide concentration is 14.95 mg/mL. Oyster hydrolysate and its ultrafiltration fraction can significantly increase the proliferation activity of TM3 cells in a concentration range of 0.25-1.00 mg/mL when it is compared with the blank control group in a concentration- and time-dependent manner（＜0.05）. The ultrafiltration components of <5 ku and 5-10 ku significantly enhanced cell proliferation and promoted testosterone secretion.【】The oyster hydrolysate and its ultrafiltration component can effectively enhance the proliferation of mouse Leydig cells and promote the secretion of testosterone.

; enzymatic hydrolysate; leydig cells; proliferative activity; testosterone

Q954.4

A

1673-9159（2019）03-0096-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.013

2019-01-25

貝類產業技術體系（CARS-49）；廣東省應用型科技研發專項資金項目（2016B020235002）

張雪妍（1992－），女，碩士研究生，研究方向：水產品加工與貯藏。E-mail:1162742815@qq.com

秦小明（1964－），男，教授，研究方向為海洋生物資源高值化利用、水產品保活運輸。E-mail:xiaoming0502@21cn.com

張雪妍，秦小明，高加龍，等. 牡蠣酶解工藝優化及其酶解產物對小鼠睪酮分泌的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（3）：96-102.

（責任編輯：劉朏）