延展顯微鏡成像技術及其應用

陳凱 張英春 趙關芳

摘?要?傳統光學顯微鏡由于光學衍射極限的限制，其分辨率不足，難以觀察亞細胞顯微結構。自超分辨顯微技術提出以來，在細胞膜蛋白等單分子成像中得到廣泛運用，并于2014年獲得諾貝爾化學獎。但這些超分辨技術多通過減少或避免處在激發體積內的分子同時發射熒光來突破光學衍射。作為一種新型超分辨手段，延展顯微鏡具有成像時間短、可標記密集生物大分子等優勢。本文介紹了延展顯微鏡的成像原理和特點，對其在亞細胞結構、神經生物學等領域的應用進行了綜述，并對其發展前景進行了展望。

關鍵詞?延展顯微鏡; 超分辨成像; 凝膠; 評述

1?引 言

目前，顯微鏡已經成為生命科學研究必不可少的工具。隨著研究的深入，許多亞細胞結構需要更高分辨率的顯微鏡。然而，點光源通過透鏡成像時，由于光學衍射會形成光斑，當兩個點光源之間的距離很小時，其光斑會重疊，無法成像。因此，光學顯微鏡的分辨率存在極限。早在1873年德國物理學家Abbe就預言了光學顯微鏡的分辨率存在極限[1]，傳統光學顯微鏡的分辨率在橫向（垂直于光傳播方向）上可達到250 nm，軸向（平行于光傳播方向）可達到550 nm[2]，而許多亞細胞結構小于此分辨率尺度，因此，研究細胞器、膜蛋白等結構還需要分辨率更高的顯微鏡。

熒光是分子在特定波長下吸收光（激發光）并發射出較長波長光（發射光），基于此可成像。超分辨熒光顯微鏡是通過改變分子的激發光或發射光，進而突破光學衍射極限的光學成像技術的總稱。超分辨熒光顯微成像技術在納米級別的微小結構以及生物大分子檢測等研究中發揮了重要的作用[3]。目前，超分辨熒光成像技術主要分為兩類： 一類是基于模式照明的超分辨熒光顯微鏡，包括受激發射損耗顯微鏡（Stimulated emission depletion，STED）[4，5]、結構光照明顯微鏡（Structured illumination microscopy，SIM）[6，7]和可逆飽和光學線性熒光躍遷顯微鏡（Reversible saturable optical fluorescence transitions，RESOLFT）[8]; 另一類是基于單分子定位的超分辨熒光顯微鏡，包括隨機光學重構顯微鏡（Stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）[9]和光激活定位顯微鏡（Photoactivated localization microscopy，PALM）[10]。

基于模式照明的超分辨熒光顯微鏡主要原理（以STED為例）為： 處于激發態的熒光分子既可通過自發熒光輻射過程以熒光的形式釋放能量回到基態，也可通過受激熒光輻射過程產生與外界輻射的頻率、位相、偏振相同的輻射但不發出熒光。STED利用以上效應疊加， 使周邊區域的熒光分子淬滅，只有中心熒光分子發光，從而突破衍射極限[4，11]。目前，對于生物樣品，使用有機染料時，STED分辨率可達20 nm; 使用熒光蛋白染料時，分辨率也可達到50～70 nm[2]。

基于單分子定位的超分辨熒光顯微鏡利用單分子熒光成像的定位精度進行超分辨成像。通過對距離較近的熒光分子分別激發，使得單個熒光分子的光斑互不影響，實現對單個分子的精確定位，并將多次成像的結果進行重構， 從而得到超分辨圖像[12]。

由于超分辨熒光顯微技術具有非侵入性、動態表征以及分辨率高的優點，目前已廣泛應用于生命體內生化反應、調控機制、生物大分子結構等研究[3]。但隨著研究的進一步深入，這些超分辨熒光顯微技術仍存在一定的局限性，例如多次成像擬合會使時間分辨率受到限制，細胞內生物大分子分布密集而無法對特定物質進行標記染色。2015年，Chen等[13]提出了延展顯微鏡（Expansion microscopy，ExM），可有效提高時間分辨率和空間分辨率。ExM是依托凝膠吸水膨脹將生物樣品中衍射極限內的熒光分子距離增大的一種新型超分辨熒光顯微技術，其分辨率至少可達到70 nm。

2?延展顯微鏡技術成像原理及優勢

ExM是利用特定熒光標記方法將用于表征生物信息的熒光信號共價連接到可吸水膨脹的凝膠上，之后凝膠擴展時，光學衍射極限內的熒光分子彼此遠離的超分辨成像顯微技術。其原理如圖1[13]所示。使用特制的標記物將表征生物信息位置的熒光分子與凝膠共價連接，當凝膠遇水擴展時，熒光分子的距離也隨之變大，之后再利用激光共聚焦顯微鏡等光學顯微鏡觀察擴展后的生物樣品。與之前的超分辨成像方法相比，由于不涉及多次采集重構等過程，可顯著提高時間分辨率。此外，擴展后的生物樣品其生物分子的密度顯著降低，對于復雜的密集生物結構，延展顯微鏡可更清晰地成像。ExM操作包括標記、凝膠化、消化、擴展以及固定成像等步驟。

2.1?標記

傳統抗體染色和基因編碼的熒光蛋白經過延展顯微鏡中凝膠、消化步驟后，熒光消失，無法成像。因此，ExM使用的標記物除常規抗體之外，還需要特定的物質使熒光分子與凝膠相連。最初，ExM使用偶聯核苷酸鏈的抗體和三功能團標記物（圖1A）共同標記，其中，三功能團標記物包括參與聚合凝膠的甲基丙烯酰基、與抗體上偶聯核苷酸鏈可互補雜交的寡聚核苷酸片段以及用于顯色的熒光團[13]。該三功能團標記物既可特定靶向生物分子，也可與凝膠聚合物連接。通過一抗、偶聯寡核苷酸鏈的二抗以及三功能團標記物先后特異性識別生物樣品后（圖1B和1C）[13]，樣品生物信息“轉移”到凝膠上，凝膠上的熒光信號即可表征生物信息。同時使用不同標記物可對生物樣品進行多色成像，觀測多種物質的分布。

除了上述標記方法外，目前，6-丙烯酰氨基己酸琥珀酰亞胺酯（AcX）[14]、甲基丙烯酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（MA-NHS）[15]等化學物質也被用于延展顯微成像。這些物質既可與氨基反應，同時也可參與凝膠。生物樣品經抗體標記后，使用上述化學物質處理可實現傳統的免疫染色與延展顯微鏡兼容。

2.2?凝膠化

ExM使用的凝膠（圖1D）多是丙烯酰胺單體和交聯劑N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酸鈉三者在引發劑過硫酸銨和加速劑四甲基乙二胺的作用下， 通過自由基聚合而成的三維多孔網狀結構[13]。過硫酸銨在水溶液中能產生SO24，使丙烯酰胺單體的雙鍵打開，活化形成自由基之后，與丙烯酸鈉和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺聚合形成凝膠。四甲基乙二胺的游離堿基可促進過硫酸銨形成SO24。不同濃度的N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺會影響凝膠擴展倍數[16]，濃度越大， 擴展倍數越小; 但濃度過小時，凝膠易斷裂，影響實驗操作[17，18]。當N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺的濃度為0.15%（w/w）時，凝膠在去離子水中可達到45倍的線性擴展，且不影響實驗操作[13]。此外，Truckenbrodt等[19， 20]提出的×10 ExM利用N，N-二甲基丙烯酰胺（DMAA）和丙烯酸鈉作為單體，經過硫酸鉀和四甲基乙二胺催化形成聚合物凝膠[21]，其在水中可達到10倍的線性擴展。

2.3?消化

經凝膠擴展后的生物樣品能否正確反映生物信息的相對位置是ExM的關鍵。為保證生物樣品各向同性擴展， ExM需使用非特異蛋白酶消化處理水凝膠和生物樣品形成的復合物，使其在擴展過程中各方向作用力相近，避免生物樣品相對位置的變化以及“偽影”的產生。Tillberg等[14]的研究表明，相比于賴氨酰肽鏈內切酶（LysC）和高壓滅菌鍋處理，蛋白酶K消化能夠更好地表現樣品原始的生物信息。由于內源性生物信息已被破壞，樣品中待測分子的空間關系保持不變，定量檢測誤差約為1%～4%。

2.4?擴展

經消化后的生物樣品凝膠復合物在水溶液中吸水脹大，即擴展過程。該步驟可使衍射極限距離內的熒光分子之間的距離增大，進而實現超分辨成像。凝膠的擴展倍數除了與凝膠單體溶液濃度相關外，還與擴展溶液存在一定的關系。由于凝膠內外的滲透壓差，消化后的凝膠在去離子水中可達到最大的擴展倍數[22]。更換3～5次水，可使凝膠的膨脹體積穩定，可增加100倍。擴展后的凝膠網絡結構如圖1E所示，經擴展后的樣品成分99%是水[14]，顏色透明，方便成像。

2.5?固定和成像

成像過程中，若將擴展后的凝膠置于普通玻片上會發生漂移的現象，嚴重影響成像。為了減少成像過程中凝膠的漂移，特別是長時間成像的實驗，需要將擴展后的凝膠固定于玻片上。目前，常用的固定方法有聚賴氨酸修飾玻片、瓊脂糖包埋及強力膠粘合。利用聚賴氨酸和凝膠之間相反電荷的吸附作用，可使擴展樣品附著于玻片上。與之相比，瓊脂糖和強力膠固定可形成不透明界面，進而引入光學散射，因此不能應用于倒置光學顯微鏡，但其附著力較強，可使樣品在數天內穩定成像[23]。

擴展后的生物樣品通過顯微鏡進行成像，目前使用較多的是寬場熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡，經過4.5倍線性擴展，ExM分辨率可達到60～70 nm[24]。

3?延展顯微鏡的發展

自Chen等[13]于2015年提出ExM概念以來，目前主要有3種不同的ExM[24]： 蛋白保留延展顯微鏡（Protein retention ExM， ProExM）用于細胞間或細胞內信號蛋白的分布研究，使用免疫染色，凝膠體積膨脹可達100倍（各方向擴展4.5倍）[14，15]; 原位雜交延展顯微鏡（Expansion fluorescent in situ hybridization，ExFISH）用于RNA結構以及納米級RNA位置的研究，由于雜交緩沖液的限制，其可引起各方向3倍的膨脹[25，26]; 迭代延展顯微鏡（Iterative ExM，iExM）通過對樣本進行兩次擴展，以獲得更高分辨率，體積膨脹可達10000倍，分辨率可達到25 nm[27]。

3.1?ProExM

ProExM通過化學試劑AcX等將標記生物樣品的抗體、鏈霉親和素或者熒光蛋白等與凝膠連接，致使抗體上的熒光信號在凝膠擴展之后仍可保留50%以上，從而實現免疫染色與ExM兼容。

針對不同的染色要求，根據AcX處理的順序將ProExM可分為三類[14]： （1）生物樣品經固定、免疫染色后，使用AcX處理，再進行凝膠化、消化、擴展成像等步驟，主要用于免疫染色的細胞和組織成像; （2）生物樣品表達熒光蛋白后固定，使用AcX處理，之后進行凝膠化等步驟，主要用于轉染熒光蛋白的生物樣品; （3）生物樣品經固定后，使用AcX處理，經過凝膠化、溫和的勻漿程序（如堿性水解變形或LysC消化）和擴展之后進行免疫染色，主要適用于擴展前排列緊密的組織或生物大分子。

除AcX外，Chozinski等[15]使用MA-NHS或GA對免疫標記的生物樣品進行處理，使免疫染色可用于ExM。MA-NHS既具有連接蛋白質的基團，也有與ExM三功能標記物相同的甲基丙烯酰基。GA既可與細胞上的氨基作用，也可與凝膠中氨基作用。

3.2?ExFISH

細胞內RNA的結構等信息對于分析細胞類型和解析表達譜具有重要作用。單分子熒光原位雜交（Single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）技術是測定RNA拷貝數以及空間定位的有效方法，但目前只能在單細胞中同時檢測10～30種RNA。Moffitt等[28]提出的Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization（MERFISH）技術，可鑒定單細胞中數千種RNA的拷貝數和空間定位，進而分析與蛋白質相關的RNA分布以及預測基因功能。但是，在細胞中，RNA分子之間相互重疊，致使高豐度RNA多重成像受到限制。

ExFISH是通過Label X等化學物質將RNA共價連接到凝膠上，利用ExM中凝膠擴展降低RNA密度，再進行RNA單分子熒光原位雜交檢測的技術。

Label X可由Label-IT Amine 和AcX合成，既可與RNA中鳥嘌呤N7反應，也可參與凝膠[26]。Label X共價連接凝膠的方法，在確保大多數RNA至少與凝膠有一個連接點的同時，會使大多數RNA中多處與凝膠共價連接，在擴展過程中，RNA可能會被拉伸。另一種將RNA共價連接到凝膠的方法是利用Acrydite修飾的poly-dT寡核苷酸鏈，既可與mRNA的polyA尾部雜交，也可與凝膠共價連接。Wang等[25]利用該寡核苷酸鏈將MERFISH技術和延展顯微技術聯用，顯著提高可測量RNA的密度。對人骨髓瘤細胞（U-2 OS）中的高豐度RNA進行MERFISH成像，檢測效率接近100%。ExFISH可用于觀察單個mRNA分子的位置以及其與蛋白質的分布，這對研究神經信號傳導以及基因表達調控具有重要作用。

3.3?iExM

傳統的ExM由于單體溶液等的限制，最多可實現4.5倍的線性擴展，iExM通過兩次凝膠擴展過程，將生物樣品進行雙倍膨脹，可達到約20（4.5 × 4.5）倍的線性膨脹，有效分辨率約25 nm。iExM的成像原理如圖2所示[27]： 生物樣品（圖2A）第一次凝膠（圖2B）過程選用了在堿性條件下可裂解的交聯劑N，N'-（1，2-二羥基乙烯）雙丙烯酰胺（DHEBA），消化擴展（圖2C）后，被常規交聯劑N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺形成的凝膠再次包埋（圖2D），經堿性溶液切割之前的凝膠后，進行二次擴展（圖2E）。在第一次凝膠過程中，不含熒光團但可與二抗上寡核苷酸鏈A'互補雜交的功能團標記物I參與凝膠（圖2F和2G），經蛋白酶消化擴展后，利用含有熒光團的三功能標記物Ⅱ進行標記（圖2H），并進行二次凝膠（圖2I），堿性條件裂解第一次凝膠后再次擴展（圖2J）。其中， 三功能標記物Ⅱ中的寡核苷酸序列A'（與二抗上偶聯的寡核苷酸鏈序列相同）和功能團標記物I中的寡核苷酸序列A可互補配對，從而使生物信息可通過二次凝膠上的熒光團加以表征。經過兩次擴展，原本距離較近的生物分子彼此遠離。iExM成像與擴展前STORM成像之間的誤差很小，約為測量長度的2.5%。iExM對于細胞的畸變約為9 nm，組織為13 nm。經iExM兩次凝膠擴展后的生物樣品可在熒光顯微鏡下解析小鼠大腦突觸結構，分析單個突觸連接問題[27]。

4?延展顯微鏡的生物學應用

研究生物大分子在細胞、組織中的分布可為生化反應、細胞間信號傳導以及細胞功能等研究提供重要的信息，ExM作為新型超分辨手段，已被應用于生物學研究的不同領域。

4.1?ExM在亞細胞結構研究中的應用

細胞的微管對于細胞器和生物大分子的分布和功能起著重要的組織作用，通常作為光學顯微鏡分辨率判斷的依據。利用ExM可對細胞中微管清晰成像，分辨率至少可達到70 nm。

Chen等[13]對HEK 293細胞中的微管進行成像（圖3A～3D），對圖3D中虛線（沿微管垂直）方向的熒光強度定量分析圖中曲線進行高斯擬合，可得到（83.8±5.68） nm的半峰全寬，該半峰全寬可表征ExM成像的有效分辨率。此外，通過ExM也可觀察到網格蛋白涂層的凹坑（圖3E和3H），相比超分辨結構光照明顯微鏡（Super-resolution structured illumination microscopy，SR-SIM）成像（圖3F，3G）更為清晰[13]。Tillberg等[14]根據ProExM步驟對細胞、組織等生物樣品進行擴展，使用共聚焦顯微鏡對擴展后HeLa細胞的遺傳編碼具有熒光團的融合蛋白進行成像，微管蛋白的半峰全寬可達67 nm，表明分辨率可達到70 nm; 同時，對網格蛋白和角蛋白雙色成像證實該方法可用于研究多種蛋白之間的位置關系。Chozinski等[15]對擴展后的PtK1細胞有絲分裂時期成像可觀察到動粒纖維微管束和染色體附著于紡錘體上，對擴展后的BS-C-1細胞內質網和線粒體成像顯示， 內質網與兩個線粒體緊密并置。利用激光共聚焦顯微鏡可觀察到iExM擴展的BS-C-1細胞微管的空心結構[23]。

4.2?ExM在神經生物學研究中的應用

神經回路中的生物大分子以及細胞間連接對于生物體正常生命活動具有至關重要的作用，研究腦組織中生物分子的分布以及突觸結構，對于治療疾病等具有重要作用。ExM也被用于解析小鼠海馬體等神經元之間的突觸連接，觀察神經遞質受體、突觸支架蛋白以及神經遞質合成酶等蛋白的分布[29～32]。

Chen等[13]對表達遺傳編碼熒光蛋白的擴展后腦組織成像，發現突觸前膜Bassoon以及突觸后膜Homer1分布于CA1腔隙分子層樹突棘（圖4A～4D），并且經ExM擴展后的腦組織在共聚焦顯微鏡下成像時，二者可清楚地區分（圖4E和4F）。Tillberg等[14]利用ProExM成功揭示了小鼠、果蠅、斑馬魚腦中的突觸結構，以及人類癲癇患者腦標本中血管附近的星形膠質細胞間隙連接，在對經ProExM擴展后的完整哺乳動物腦組織表達的熒光蛋白成像時，可清晰觀察到樹突狀脊柱形態，以及薄的脊柱頸部。Chozinski等[15]對擴展后的THY1-YFP-H小鼠腦組織成像，可清晰地觀察到突觸和樹突棘之間的連接。

4.3?ExM在其它領域中的應用

除了用于研究蛋白質的結構和功能、細胞與細胞之間的相互作用外，ExM也被用于RNA等物質的成像。Chen等[26]對長鏈非編碼RNA進行成像，觀測到了NEAT1 lncRNAs清晰的環形形態以及lncRNA XIST滅活X染色體的圖像（圖5A～5E）。擴展后的小鼠腦組織樣品，在寬視野顯微鏡下可清晰觀測到YFP mRNA定位于YFP熒光細胞，谷氨酸脫羧酶1（Gad 1）mRNA定位于皮層和海馬的特定層中具有特征性排列的細胞群，在共聚焦顯微鏡最大放大倍數下，可觀測到單個轉錄產物，達到單分子精度，在3 h內，即可完成575 μm × 575 μm × 160 μm組織樣品的測量。Wang等[25]對U-2 OS同時利用ProExM標記鈣粘蛋白和MERFISH標記RNA的實驗證實，二者可兼容，不會影響彼此的實驗結果。哺乳動物細胞中存在數以萬計的RNA，延展顯微技術將RNA彼此分離，降低密度，可顯著提高單個細胞中RNA測量的種類。而MERFISH和proExM的聯用，可在單細胞中同時進行轉錄組學和蛋白質組學的測定。

5?總結與展望

目前，ExM已經實現與傳統免疫染色兼容，通過改變凝膠單體、交聯劑的種類和濃度可達到10倍的線性擴展，通過2次凝膠擴展可達到20倍的線性膨脹，分辨率逐步提高。將ExM和SIM兩種超分辨技術聯用，對人類病原體賈第蟲的細胞骨架成像，證實其在超高分辨水平下的各項同性擴展，兩種超分辨技術聯用可使空間分辨率達30 nm [33，34]。然而，對于其它的超分辨技術，如單分子定位顯微鏡，其與ExM聯用還存在諸多問題： 凝膠擴展過程中使軸向厚度增加，超過了油鏡成像的高度，影響成像精度; 基于單分子定位的超分辨熒光顯微鏡特殊的成像緩沖溶液會對凝膠的擴展產生影響，導致擴展倍數變小; 現有的染色標記方法對于擴展后的樣品標記密度較低[35，36]。而且，隨著分辨率提高，探針[37]的大小也將成為阻礙成像分辨率提高的主要因素。此外，ExM研究多處于技術證實階段，主要對已知形態的細胞微管蛋白以及腦組織結構等成像[38～41]，而對于其它亞顯微生物學樣品[42]的成像研究甚少。隨著研究深入，ExM依靠其時間分辨率以及減小生物信息密度等優勢，將被應用于越來越多的單分子成像。

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