HBV聚合酶活性區變異與臨床病情變化及HBsAg陽性相關性

夏 紅，楊 強

(重慶市大足區人民醫院感染科，重慶 402360)

我國是乙型肝炎高發國，HBV反復、持續感染是一系列肝臟疾病的危險因素，包括肝炎性、肝硬化、肝癌等[1]。目前，抗病毒治療是防止乙肝發展為肝硬化、肝癌的主要療法；核苷酸類藥物如拉米夫定可以通過抑制HBV DNA復制，從而有效治療HBV感染，而且是主要的抗病毒藥物[2]。研究顯示，治療可以顯著改善HBV感染患者的臨床、生化和病毒學等指標，且使肝組織炎性壞死等病理損害明顯好轉[3]。但研究顯示，拉米夫定絡氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(tyrosine methionine aspartate aspartate, YMDD)變異率隨著抗病毒治療時間延長而逐漸增高[4]，并認為這些變異可能是治療失敗或產生耐藥性的原因[5]。本文研究HBV聚合酶YMDD變異與乙型肝炎臨床病情變化及HBsAg的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014至2016年間在本院就診的慢性乙型肝炎患者290例，均符合2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》慢性乙型肝炎診斷標準[6]。其中男196例，女94例，年齡17～76歲，平均年齡(47.5±13.7)歲。無癥狀攜帶者(asymptomatic carriers, ASC)56例，急性肝炎(acute hepatitis, AH)55例，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)68例，肝硬化(cirrhosis of liver, LC)53例，重型肝炎(severe hepatitis, SH)31例，原發性肝癌(primary hepatocellular carcinoma, PHC)27例。患者接受拉米夫定治療12～48月，平均(31.5±6.5)個月。分別于治療前及治療中每4～6月抽取患者外周血，分離血清，-70 ℃儲存，待測。

1.2 試劑

使用ABI 7700熒光PCR擴增儀(美國BIO～RAD公司)、乙型肝炎病毒核酸擴增(polymerase chain reaction, PCR)熒光定量試劑盒及YMDD變異檢測試劑盒(廣州市達暉生物技術有限公司)測定纈氨酸突變型(tyrosine valine aspartate aspartate,YVDD)對照品、異亮氨酸突變型(tyrosine isoleucine aspartate aspartate,YIDD)突變類型；使用人乙肝表面抗原(HBsAg)Elisa試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司)測定HBsAg。

1.3 實驗方法

1.3.1 HBV變異檢測 (1)樣本處理：取50 μL待測血清標本、陰性血清對照品、強陽性和臨界陽性于1.5 mL離心管中，分別加入50 μL核酸提取液，混勻，2 000 rpm離心10 s，100 ℃水浴10 min，12 000 rpm離心10 min，取上清，-20 ℃保存，待測。(2)上樣：在HBV反應混合液A的反應管中分別加入4 μL的陰性對照、強陽性對照、臨界陽性對照、待檢測樣品處理上清液、HBV定量標準品。在HBV反應混合液B和C的反應管中分別加入4 μL的強陽性對照、待檢測樣品處理上清液、YVDD對照品、YIDD對照品。蓋緊反應管，轉移至檢測區。(3)PCR擴增及熒光檢測：反應管置于PCR儀上進行擴增，擴增條件：37 ℃ 2 min；95℃ 5 min；94 ℃ 20 s，62 ℃ 60 s，循環40次，熒光檢測。(4)結果分析：如果樣品的反應混合液B檢測陰性，反應混合液C檢測陽性，則可判定該樣品為YIDD突變株。如果樣品的反應混合液B檢測陽性，反應混合液C檢測陰性，則可判定該樣品為YVDD突變株。如果樣品的反應混合液B檢測陰性，反應混合液C檢測陰性，則可判定該樣品為野生型株。如果樣品的反應混合液B檢測陽性，反應混合液C檢測陽性，則判定該樣品為YVDD、YIDD共生株。

1.3.2 生化指標檢測 使用全自動生化檢測儀檢測血清AST、ALT、ALP和TBIL表達水平。

1.3.3 HBsAg檢測 抽取患者靜脈血，收集血清。設置空白孔和待測樣品孔。待測樣品孔中依次加入40 μL樣品稀釋液、10 μL待測樣品，輕搖混勻，37 ℃×30 min，洗板5次；加入50 μL酶標試劑，37 ℃×30 min，洗板5次；依次加入顯色劑A和B各50 μL，輕搖混勻，避光37 ℃×15 min，終止反應；以空白孔調零，依序測量各孔吸光度(450 nm)；繪制標準曲線，代入樣品OD值計算出濃度，再乘以稀釋倍數，即實際濃度?？瞻讓φ湛撞患訕悠芳懊笜嗽噭溆喔鞑讲僮飨嗤?/p>

肝穿刺：患者取仰臥位，穿刺點位于右側腋中線第8和第9肋間、肝實音處穿刺，局部皮膚消毒，肝被膜用2%利多卡因局部麻醉，三棱針刺孔，由刺孔刺入穿刺針，注射器推出0.5～1.0 cm防止針頭堵塞，注射器抽成負壓并保持，叮囑患者吸氣，深呼吸末屏住呼吸，將穿刺針刺入肝內并抽出，生理鹽水沖出肝組織條，10%甲醛固定送檢。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 患者一般情況分布特征

病毒變異組和無變異組的性別、年齡、病程、乙肝疫苗接種史和HBV家族感染史等一般臨床資料相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 患者一般情況特征分布

2.2 病毒變異與患者病情分布的關聯

病毒變異組與無變異組的病情分布差異有統計學意義(P<0.05)；病毒變異組患者的肝功能指標表達水平與無變異組差異有統計學意義(P<0.05)，病毒變異組AST、ALT、ALB和TBIL水平顯著高于無變異組。見表2。

表2 兩組患者病情分布特征

2.3 病毒變異與無變異患者HBsAg陽性率及表達方式對比

變異組140例患者中，肝細胞內HBsAg表達陽性104例，陽性率為74.29%，無變異組150例患者中，肝細胞內HBsAg表達陽性91例，陽性率為60.67%，變異組顯著高于無變異組(χ2=4.541，P=0.033)。變異組的HBsAg表達方式主要以漿核型為主，約占陽性表達患者的47.25%，無變異組的表達方式主要以核型為主，約占陽性表達患者的46.15%，兩組表達方式差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 病毒變異與患者HBsAg陽性率及表達方式 (例，%)

3 討 論

HBV DNA復制起始于蛋白啟動的逆轉錄機制，HBV聚合酶蛋白在其中發揮關鍵作用[7]；但由于HBV聚合酶缺乏3′～5′校對能力，發生核苷酸替代變異后難以修正，所以HBV是一個高度變異的病毒，而這些突變以準種的形式存在于體內，病毒準種的進化依賴于抗病毒藥物、免疫應答、復制適用性等為更強適用性的變異株提供復制空間[8]；與野生株相比，HBV突變株在沒有藥物壓力下復制能力較低，但抗病毒藥物治療可以改變宿主機體內環境，使變異株的復制適用性超過野生株。一段時間后，野生株感染的肝細胞以細胞更新的方式被清除，并取代以未感染的細胞，而未被感染的細胞很容易被變異株感染[9]。研究顯示，HBV的變異與HBV P蛋白YMDD基因序列突變有關[10]。

本文研究發現，與未變異組相比，病毒變異組的病情分布差異有統計學意義。變異組患者的肝功能指標，如AST、ALT、ALB和TBIL的表達水平顯著升高。ALT和AST主要存在于肝細胞線粒體中，是肝臟損傷的重要血清標志物。變異組升高更加明顯，其原因可能與YMDD變異后，治療藥物對變異的HBV失去原有的治療作用有關，從而使變異株病毒滴度升高，更多的病毒顆粒作用于肝細胞，肝細胞病理狀態進一步惡化，病情加重[11]。同時，本文研究還發現，病毒變異組患者HBsAg表達陽性率顯著低于無變異組。HBsAg是HBV病毒復制過程中產生的重要病毒蛋白，其在病毒對宿主的黏附及HBV持續感染和發病機制方面均有重要作用[12]。研究表明，HBsAg是機體特異性細胞毒性T淋巴細胞攻擊的主要靶抗原，其在肝組織內的表達水平，反應HBV患者機體免疫水平和HBV復制之間的平衡，臨床上通常把HBsAg的表達作為HBV復制的重要標志，能反映肝臟的炎癥活動度和纖維化程度，而非活動性病毒復制階段多表現為陰性[13]。研究表明，機體免疫應答增強并啟動對HBV清除，繼而攻擊并大量破壞被HBV感染的肝細胞，肝組織發生纖維化及壞死等，正常肝細胞不斷減少，肝細胞內HBV病毒顆粒不斷減少，導致HBsAg水平不斷降低[14]。研究發現，肝細胞內HBsAg的表達形式有胞槳型、胞核型、漿核型3種，其表達方式與HBV感染的不同時期有關[15]。慢性HBV感染的自然史分為免疫耐受期、免疫清除期、非活動攜帶狀態機再活動期4個階段[16]。早期免疫耐受期HBsAg在肝細胞內的表達以核型為主，此時肝臟很少或沒有炎癥活動，多見于兒童和青年人；而在免疫清除階段，HBsAg在肝細胞內的表達以槳型和/或漿核型為主，多見于活動型肝炎患者[17]。本文研究顯示，變異組的HBsAg表達形式主要是漿核型，約占陽性表達患者的47.25%，而無變異組的HBsAg表達方式主要以核型為主，約占陽性表達患者的46.15%，兩組HBsAg表達方式差異有統計學意義。

本文研究結果提示，HBV聚合酶YMDD變異的乙肝患者臨床病情更重，HBV表面抗原陽性表達比例低。

致謝：感謝我院、感染科的相關醫護人員及入院患者對本研究的支持。