超聲波輔助亞麻籽粕醇法脫色的研究

田博宇 焦英帥 姚亞亞 趙安鵬 李慧靜

(河北農業大學食品科技學院，保定 071001)

亞麻是一年生草本植物，可細分為纖維用亞麻、油用亞麻和油纖兼用亞麻3種類型，其中油用亞麻又稱之胡麻。油用亞麻主要種植于加拿大、中國、阿根廷、美國，其種子可榨油，是世界十大油料作為之一，年產油量位列第七。油用亞麻在中國有廣泛種植，主要分布于華北、西北東北高寒地區，目前已是我國第四大油料作物[1]。長期以來，雖然油用型亞麻在我國廣有種植，但營養、安全、健康的優質亞麻籽油卻長期被大眾忽視。隨著亞麻籽中生物功能性成分的開發和亞麻籽精深加工的延伸，亞麻種植面積和亞麻籽產量將迎來新的增長動力。亞麻籽粕是亞麻籽經過溶劑浸提或冷法壓榨提油后的殘余物，其中粗蛋白質量分數約為23%～33%，是優質的植物蛋白資源。然而，亞麻粕直接用于動物飼料或漚制后作為植物肥料，這使得其中的營養成分未得到充分利用，造成了極大的資源浪費和經濟損失。

目前，學者們對于植物蛋白提取方法已經有了深入研究，主要有堿溶酸沉法、超聲波法、復合酶法、有機溶劑提取法[2]。堿溶酸沉法是利用多數植物蛋白等電點在酸性范圍，而在堿性條件下植物蛋白會從植物細胞中溶出，后期利用酸調節蛋白提取液pH值至蛋白等電點，使蛋白外層電荷破壞而聚集析出。該法在亞麻籽粕蛋白提取工藝報道中廣泛使用，同時此法因加工成本低、生產工藝便捷深得企業工業化制備亞麻蛋白所喜愛。但綜合以前報道，亞麻蛋白提取主要關注其提取率，對制備蛋白色澤品質卻少有報道，本實驗室在以冷榨亞麻籽粕，采用堿溶酸沉法制備亞麻粕籽蛋白時發現，獲取的亞麻蛋白呈現青褐色，且以堿溶pH 條件增加對蛋白色澤品質劣變尤為嚴重。分析原因，通過堿溶酸沉法制備亞麻粕蛋白時，部分色素會隨著蛋白沉淀而富集。同時在堿溶酸沉工藝流程中，大量的堿液會使酚類物質氧化為醌[3]，進而造成最終蛋白色澤劣變，使其在食品中應用受限。而亞麻籽中亞麻木酚素，通常約占籽質量的0.9%～1.5%[4-5]，比其他已知富含木酚素的66種食品高100～800倍，這使得酚轉化為醌造成的亞麻籽粕蛋白色澤劣變較其他植物蛋白生產問題尤為突出。因此必須在制備過程中進行適度脫色，目前對于不同原料脫色以吸附法和萃取法較為廣泛。陸晨等[6]研究了活性炭對茶渣中植物蛋白吸附能力，發現在蛋白白度同產率相互制約，且當脫色率達到90%時，蛋白損失率超過60%。鄭仕遠等[7]采用苯、汽油、丙酮、乙醚等對蠶蛹脫色，雖效果不錯，但存在環境污染和有機試劑成本過高等不足。無水乙醇是食品工業常見的有機溶劑，低毒、成本低、易操作，同時乙醇可以通過復蒸法回收反復利用，符合大規模工業生產要求。

超聲波是一種頻率高于2 kHz的聲波。超聲波提取技術是指將超聲波所產生的空化、攪拌、振動等綜合效應應用于天然有效成分提取中[8]。利用聲能，破壞細胞壁、細胞膜，高效便捷的從原料中提取內容物。此外超聲波輔助提取技術不受地域和原料限制，適用于與大多數天然成分提取。綜合經濟效益，超聲波輔助提取是一種高效、節能、便捷的高新技術[9]。本研究從實際加工條件，確定了以超聲波輔助冷榨亞麻籽粕水醇法脫色后進行蛋白提取的工藝流程。亞麻籽粕白度同蛋白提取率互相影響，需結合實際生產情況選取脫色條件。通過單因素及正交實驗優化亞麻粕脫色工藝條件，以期為生產出品質優良的亞麻籽粕蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨亞麻籽粕，中藥粉碎機粉碎過80目篩后備用。氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸、無水乙醇、氯化鈉、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白均為分析純試劑。

1.2 儀器設備

SD5200H液晶超聲波清洗器；L3660D低速離心機；HH-601超級恒溫水浴；ZNCL-S140X140磁力攪拌器；STARTER3100型pH計；752N紫外-可見分光光度計；WSB-VI型智能白度測定儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白含量測定

粗蛋白的測定：凱氏定氮法，GB/T 9823—2008《糧油檢驗 植物油料餅粕總含氮量的測定》，其中氮換算指數為6.25。

1.3.2 亞麻籽粕脫色效果測定

超聲波輔助水醇法脫色亞麻籽粕經冷凍干燥(冷阱溫度-35 ℃, 干燥室真空度30 Pa)后，研碎后測定白度。

1.3.3 脫色亞麻籽粕蛋白的提取

準確稱取5.000 g脫色亞麻籽粕至于雙層夾套燒杯中，按料液比1∶20加入蒸餾水，用0.1 mol/L、1 mol/L NaOH調節溶液至pH 9，60 ℃水浴，每隔10 min調節1次pH，堿提60 min后，4 200 r/min 轉速下離心20 min，取上清液備用。

1.3.4 蛋白提取率測定

蛋白提取率測定：采用考馬斯亮藍法[10]，將提取液用蒸餾水稀釋20倍，取稀釋液0.1 mL于試管中，零參管以0.1 mL 0.15 mol/L NaCl 代替，再加入考馬斯亮藍G-250染色液5 mL，振蕩搖勻，室溫靜置10 min后，在595 nm處測定吸光值。以牛血清白蛋白為標準品測定的標準曲線為：y=1.10878x-0.010 34,R2=0.991 9。固體中蛋白質含量參照GB/T 9823—2008進行測定。

1.3.5 亞麻籽粕脫色單因素實驗

以乙醇濃度、料液比、水浴溫度、超聲波處理時間為考察因素，以脫色后亞麻籽粕白度和蛋白提取率為評價標準，確定各個因素對亞麻籽粕脫色效果影響。

1.3.5.1 乙醇濃度的影響

在水浴溫度30 ℃、料液比1∶20、超聲波處理時間20 min的條件下，乙醇體積分數分別為10%、20%、30%、40%、50%時進行單因素實驗，根據脫色后亞麻籽粕白度及蛋白提取率確定較優乙醇濃度。

1.3.5.2 料液比的影響

在水浴溫度30 ℃、乙醇體積分數20%、超聲波處理時間20 min的條件下，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30時進行單因素實驗，根據脫色后亞麻籽粕白度及蛋白提取率確定較優料液比。

1.3.5.3 水浴溫度的影響

在料液比1∶20、乙醇體積分數20%、超聲波處理時間20 min的條件下，水浴溫度分別為10、20、30、40、50 ℃時進行單因素實驗，根據脫色后亞麻籽粕白度及蛋白提取率確定較優水浴溫度。

1.3.5.4 超聲波處理時間的影響

在料液比1∶20、乙醇體積分數20%、水浴溫度30 ℃的條件下，超聲波處理時間分別為5、10、15、20、25 min時進行單因素實驗，根據脫色后亞麻籽粕白度及蛋白提取率確定較優超聲波處理時間。

1.3.6 正交實驗

優化亞麻籽粕脫色條件，在單因素試驗基礎上，通過L9(34)正交實驗進一步優化亞麻籽粕脫色條件，正交實驗因素及水平表見表1。

表1 正交實驗因素及水平表

1.3.7 數據統計方法

采用 SPPS17.0 軟件對實驗數據進行方差分析(ANOVA)，多組實驗數據見差異性比較選用Duncan檢驗，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同單因素對于亞麻籽粕脫色效果影響

2.1.1 乙醇濃度對亞麻籽粕脫色效果的影響

乙醇濃度對亞麻籽粕白度及蛋白提取率的影響如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對亞麻籽粕白度及蛋白提取率的影響

結果顯示，隨著乙醇濃度的增加，亞麻籽粕白度先增加后減小白度在乙醇體積分數為20%時最大，分析其原因在于隨著乙醇濃度增加，原有亞麻籽粕中的色素及酚類物質適量脫除，使得亞麻籽粕白度增加，但過高的乙醇濃度同樣會使亞麻籽粕中蛋白發生變性，進而使亞麻籽粕顏色發生劣變。蛋白提取率隨著乙醇濃度增加呈現一定上升趨勢，但各個組別間差異不顯著，且考慮到高濃度乙醇會使蛋白因外部水化層破壞而發生變性。故綜合分析乙醇濃度增加最亞麻籽粕白度及蛋白提取率影響，確定乙醇體積分數為20%較為合適。

2.1.2 料液比對亞麻籽粕脫色效果的影響

料液比對亞麻籽粕白度及蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 料液比對亞麻籽粕白度及蛋白提取率的影響

結果顯示，隨著料液比加大，亞麻粕白度呈現上升趨勢，其原因在于隨著料液比加大，溶液中C2H5OH凈含量增加，有助于色素及酚類物質脫除。但蛋白提取率同白度增加趨勢相反，原因在于，隨著料液比加大，水溶性蛋白損失增加，進而影響最終蛋白提取率。綜合考慮，料液比應控制在1∶25。

2.1.3 水浴溫度對亞麻籽粕脫色效果的影響

水浴溫度對亞麻籽粕白度及蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 水浴溫度對亞麻籽粕白度及蛋白提取率的影響

結果顯示，隨著溫度升高，亞麻粕白度呈現上升趨勢，但溫度在40 ℃后，白度上升速率減緩，分析其原因在于原有亞麻籽粕中呈色物質下降到閾值后，溫度升高對亞麻籽粕白度影響不顯著。蛋白提取率總體隨著溫度升高呈現倒“V”形，分析亞麻籽粕蛋白提取率隨著脫色溫度升高而增加的原因在于亞麻籽粕中蛋白在此期間有適當析出,因此后期蛋白提取過程中其蛋白提取液蛋白濃度增高，但在30 ℃后，脫色實驗溫度升高，使得蛋白溶解于亞麻籽粕脫色液中，進而使得最終蛋白提取率降低。綜合考慮，水浴溫度確定為30 ℃。

2.1.4 超聲波處理時間對亞麻籽粕脫色效果的影響

超聲波處理時間對亞麻籽粕白度及蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 超聲波處理時間對亞麻籽粕白度及蛋白提取率的影響

結果表明，隨著隨著超聲波處理時間延長，亞麻籽粕白度呈現上升趨勢，蛋白提取率呈現下降趨勢，但是各組數據間差異均不顯著。綜合考慮，超聲波時間確定在15 min左右。

2.2 正交實驗結果

通過單因素實驗發現，脫色亞麻籽粕的白度同蛋白提取率基本呈負相關，且各因素對兩者影響又存在差異，說明各單因素之間同樣存在影響。為了進一步優化超聲波輔助水醇法亞麻籽粕脫色條件，根據各單因素數據分析結果，亞麻籽粕脫色正交實驗結果見表2。

表2 亞麻籽粕脫色正交實驗結果

白度主體間效應檢驗見表3，由表3可得，矯正模型的顯著水平小于0.01，表明模型顯著性極好。乙醇濃度、水浴溫度兩因素的顯著水平均小于0.01，說明乙醇濃度和水浴溫度對亞麻籽粕白度有極顯著影響。料液比因素的顯著水平小于0.05，說明料液比對亞麻籽粕白度有顯著影響。超聲波處理時間因素的顯著水平大于0.05，說明超聲波處理時間對亞麻籽粕白度無顯著影響。通過比較分析確定出最優組合為A2B1C3D3。由表4可得，矯正模型的顯著水平小于0.01，表明模型顯著性極好。乙醇濃度、料液比兩因素的顯著水平均小于0.01，說明乙醇濃度和料液比對脫色亞麻籽粕蛋白提取率有極顯著影響。水浴溫度、超聲波處理時間兩因素的顯著水平均小于0.05說明水浴溫度和超聲波處理時間對脫色亞麻籽粕蛋白提取率有顯著影響。通過比較分析確定較優組合為A2B2C3D3、A2B3C3D3。從兩者最優組合來看實驗設計各因素相互制約，互為影響。需要綜合分析，選取符合實際生產需要的脫色條件。本實驗綜合分析亞麻籽粕白度和和脫色亞麻籽粕蛋白提取率，選擇正交實驗第5組方案(A2B2C3D1)為較優組合，即乙醇體積分數20%、料液比1∶25、水浴溫度40 ℃、超聲波處理時間10 min，此條件下亞麻籽粕白度為46.80，脫色亞麻籽粕蛋白提取率為43.84%。

表3 白度主體間效應檢驗

表4 蛋白提取率主體間效應檢驗

2.3 驗證實驗

在3個燒杯中分別準確稱取10.000 g亞麻籽粕，按料液比1∶25加入乙醇溶液，水浴溫度30 ℃，超聲波處理10 min后，4 200 r/min 轉速下離心4 min，取沉淀冷凍干燥(冷阱溫度-35 ℃，干燥室真空度30 Pa)后測定白度。

準確稱取5.000 g脫色亞麻籽粕于雙層夾套燒杯中，按料液比1∶20加入蒸餾水，用0.1 mol/L、1 mol/L NaOH調節溶液至pH 9，60 ℃水浴，每隔10 min調節1次pH，堿提60 min后，4 200 r/min 轉速下離心20 min，取上清液備用。驗證實驗結果見表5。

表5 驗證實驗及結果

結果表明，采用超聲波輔助法進行亞麻籽粕脫色的白度及蛋白提取率分別為46.77%和43.96%，變異系數分別為1.50%和1.00%，實驗數據具有較好重復性，說明此方法穩定可靠。

2.4 討論

冷榨亞麻籽粕磨粉80目過篩后，測定白度為17.01，粗蛋白質量分數為32.71%，以此為原料獲取的亞麻籽粕蛋白為青褐色。通過預實驗，比較對亞麻籽粕超聲波輔助水醇法脫色后進行蛋白提取、提取亞麻籽粕蛋白后進行超聲波輔助水醇法脫色2種工藝流程，發現因為亞麻籽粕中富含亞麻籽膠[11]，若采用后者工藝流程會導致蛋白提取液酸沉階段，蛋白難以離心，故而確定工藝流程為對亞麻籽粕先脫色后進行蛋白提取。實驗表明，亞麻籽粕白度同蛋白提取率相互制約，亞麻籽粕白度通常同脫色條件加劇而增加，但劇烈的條件同樣會引起亞麻籽粕蛋白變性以及蛋白提取率降低，需要結合生產實際情況已經經濟成本確定適當條件。

3 結論

經過正交實驗優化并綜合考慮亞麻籽粕白度和脫色亞麻籽粕蛋白提取率，本實驗確定乙醇體積分數20%、料液比1∶25、水浴溫度40 ℃、超聲波處理時間10 min為最適脫色條件，此條件下亞麻籽粕白度為46.80，脫色亞麻籽粕蛋白提取率為43.84%。