補精益視片對SD大鼠慢性高眼壓模型初級視皮質PI3K/Akt 通路磷酸化FoxO1和IKK2表達的影響

袁銘悅 李翔 劉紅佶 李祥玉

青光眼(glaucoma)是以特異性視神經(jīng)(optic nerve，ON)損傷和視功能損害為特征的一類眼病，為全球僅次于白內障、可導致視力喪失的主要原因[1]。青光眼視功能損害的病因、病機復雜，迄今尚未明確。病理性眼壓(intraocular pressure，IOP)升高是青光眼視功能損害的基本因素，但并不是唯一因素，即使藥物和手術有效控制眼壓，其視功能損害仍在緩慢進展。近年許多學者提出青光眼是一種中樞神經(jīng)退行性病變[2]，其病變涉及了包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)、視神經(jīng)、視交叉、視束、外側膝狀體(lateral geniculate nucleus，LGN)、視放射、視皮質(visual cortex，VC)整個視路。Qing G等[3]利用核磁共振檢查原發(fā)性開角型青光眼患者發(fā)現(xiàn)中心視野未受損時相對應的VC區(qū)的神經(jīng)元已出現(xiàn)了對視覺刺激的反應下降，表明青光眼患者視皮質神經(jīng)元損傷可能早于目前常用視野計能檢測到的視野改變，由此推斷青光眼患者視皮質的改變可能不僅是RGCs及視神經(jīng)的損傷的繼發(fā)改變，還有可能主動參與了青光眼的發(fā)病。目前中醫(yī)藥對青光眼初級視皮質改變干預的相關研究并不多。

本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈法[4]誘導產(chǎn)生眼壓維持穩(wěn)定、持續(xù)時間較長的慢性高眼壓(elevated intraocular pressure，EIOP)模型，選用補精益視片作為干預藥物，通過測量SD大鼠眼壓(intraocular pressure，IOP)，初級視皮質(primary visual cortex，PVC)磷酸化FoxO1、IKK2含量等客觀指標，觀察補精益視片對大鼠慢性EIOP模型PVC損害的干預，探討SD大鼠慢性EIOP模型視功能損害的中樞機制和補精益視片的干預及作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 由成都達碩實驗動物有限公司(生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030)提供的清潔級SD大鼠(生產(chǎn)批號：20170915)30只，雌雄各半，8～12周齡，體重約160～200g。飼養(yǎng)條件：空氣流通，相對濕度55%～75%，室溫20～25℃，12小時光照維持，晝夜循環(huán)，自由攝食飲水。納入標準：①外眼無異常；②雙眼瞳孔直間接對光反射無異常；③無歪頸。

1.1.2藥品及試劑 補精益視片(成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供，組成：枸杞子、菟絲子、楮實子、五味子、丹參、三七、車前子、茺蔚子、木瓜、青皮)批號：20170328。FoxO1(phospho-Ser319)抗體、IKK2抗體均由美國BeacomBio提供，批號分別為：BIO95906、BIO87319。

1.2 方法

1.2.1分組與給藥方法

購回動物后，適應性喂養(yǎng)3天，進行IOP測量，正常IOP區(qū)間估計，取平均IOP在9～18mmHg者，以SPSS 20.0統(tǒng)計軟件產(chǎn)生隨機數(shù)字，分為3組，對照組，模型組和給藥組進行單眼(右眼)造模。

對照組和模型組每天予3ml生理鹽水灌胃，給藥組以成人劑量20倍換算，每天予1.8g/kg體重的補精益視片混懸液3ml灌胃，每周稱體重1次，根據(jù)大鼠體重變化調整給藥量。造模后3天開始，每日同一時間段(16:00～17:00)給藥，連續(xù)8周。

1.2.2造模方法

模型組和給藥組在眼科顯微鏡下烙閉右眼上鞏膜靜脈法[4]進行造模。對照組暴露上鞏膜經(jīng)脈行假烙閉處理。方法如下：大鼠稱重后，3%戊巴比妥鈉按1.2ml/kg體重行左下腹腔注射，0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液滴術眼；消毒；于10點至2點鐘位距角鞏膜緣1～2mm剪開上方球結膜，分離筋膜；角鞏膜緣后3～4mm近赤道部10點、12點和1點處可以發(fā)現(xiàn)支上鞏膜靜脈，以眼科手術止血器烙閉，整復球結膜，涂金霉素眼膏，待大鼠蘇醒后放回籠內。0.25%氯霉素眼液滴眼，2次/日，連續(xù)用藥1周。對照組眼科手術止血器不開開關而不起烙閉作用，其余操作相同。左眼不做處理。

1.2.3取材方法

大鼠灌胃8周后，大腦灌注固定法(參陳浩宇等[5]，結合本實驗加以改良)： 3%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉大鼠，仰臥暴露腹部，固定四肢，劍突下剪開胸腔，暴露心臟，夾閉腹主動脈和下腔靜脈，將套有16號灌胃針針頭的注射器經(jīng)左心室插入升主動脈，同時剪開右心耳，快速推注含肝素鈉注射液(20u/ml)生理鹽水50 ml沖洗，以無血液流出為度，換4%多聚甲醛溶液50～80 ml灌注固定，先快后慢，約10～15 min推完固定液，灌注結束后，開顱取出腦組織，固定液固定72h。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1眼壓測量

TNON-PEN XL眼壓計每天同一時間段(14:00～16:00)測量IOP。術前3天連續(xù)測量，取平均值為正常IOP；術后即刻、1w、2 w、4w、6w、8w各測1次各組大鼠右眼IOP。

1.3.2免疫組化檢測PVC中磷酸化FoxO1、IKK2

腦組織固定72h后，參照《大鼠腦立體定位圖譜(第三版)》[6]切取視皮質區(qū)腦組織，標本逐級酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做4μm連續(xù)切片，烘干備用。分別行FoxO1(phospho-Ser319)及IKK2抗體染色，檢測PVC磷酸化FoxO1、IKK2含量。光學顯微鏡下采用免疫組化染色后PVC組織內細顆粒狀、細絲狀黃色至棕黃色。每組測定6只大鼠，每只測定1張PVC切片(每張取5個視野)，用 Mias-2000型圖形圖像分析儀測量PVC部位的p-FoxO1、IKK2陽性染色總面積(單位：S/μm2)、積分光密度及平均光密度。求取每張切片5個視野的染色面積總和、積分光密度總和及平均光密度。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型IOP的影響見表1

經(jīng)檢驗，各組IOP均為正態(tài)分布，且方差齊。造模前各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各組間均衡可比。造模后即刻，對照組IOP較造模前略升高，但與造模前相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組、給藥組眼壓升高明顯，與造模前及對照組造模后即刻IOP相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。造模后8周，模型組與給藥組IOP與造模前相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與造模后即刻相比，模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給藥組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠組間及造模、用藥前后IOP比較

注：☆與對照組造模后即刻比較，P<0.05；★與同一組別造模前比較，P<0.05；△與同一組別造模后即刻比較：給藥組P<0.05。

2.2 補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型PVC中磷酸化FoxO1表達的影響見表2(圖1)

經(jīng)檢驗，三組總面積、積分光密度、平均光密度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較：模型組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。選取免疫組化法檢測的三組SD大鼠PVC中磷酸化FoxO1表達的典型光鏡圖見圖1(400×)。

表2 補精益視片對SD大鼠EIOP模型PVC中磷酸化FoxO1表達的影響

注：☆與對照組比較，★與對照組比較，△與模型組比較，均為P<0.05。

圖1 各組大鼠PVC中磷酸化FoxO1含量(免疫組化×400)

2.2 補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型PVC中磷酸化IKK2表達的影響見表3(圖2)

經(jīng)檢驗，三組總面積、積分光密度、平均光密度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較：模型組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。選取免疫組化法檢測的三組SD大鼠PVC中IKK2表達的典型光鏡圖見圖2(400×)。

表3 補精益視片對SD大鼠EIOP模型PVC中磷酸化IKK2表達的影響

注：☆與對照組比較，★與對照組比較，△與模型組比較，均為P<0.05。

圖2 各組大鼠PVC中IKK2含量(免疫組化×400)

3 討論

青光眼類似中醫(yī)“五風內障”及“青盲”，多由風、火、痰、郁、虛等導致氣血失和、氣滯血瘀、玄府閉塞、神水瘀積為病，病久肝腎兩虧，神光衰微甚至泯滅、不睹三光而成“青盲”，所以肝腎虛損、脈絡瘀滯是青光眼視功能損害的主要病機，滋養(yǎng)肝腎、活血化瘀為防治青光眼視神經(jīng)損害的基本方法[7]。

補精益視片(組成：枸杞子、菟絲子、楮實子、五味子、丹參、三七、車前子、茺蔚子、木瓜、青皮)是根據(jù)陳達夫教授經(jīng)驗制成的成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內制劑。方中枸杞子、菟絲子、楮實子、五味子滋養(yǎng)肝腎、益精明目，丹參、三七活血化瘀、通利血脈，車前子、茺蔚子、楮實子利水滲濕、助降眼壓，木瓜、青皮行氣通絡、消積化滯而使全方補而不滯，且氣行則血行，有助活血通絡，全方共奏滋養(yǎng)肝腎、活血化瘀功效。我們前期工作發(fā)現(xiàn)[8-12]：補精益視片治療眼壓控制后青光眼療效確切，可不同程度改善患者中醫(yī)癥狀，提高視力、視覺敏感度，有效控制視野缺損，從而保護青光眼患者視功能；可降低慢性EIOP模型大鼠眼壓、提高RGCs數(shù)量，增加視網(wǎng)膜厚度，改善RGCs超微結構，上調視網(wǎng)膜PI3K/Akt信號轉導通路中p-Akt的表達，促進LGN中BDNF的表達、提高尼氏小體含量，保護慢性EIOP模型SD大鼠的視功能。

近年來，關于PI3K/Akt信號通路(磷酸肌醇-3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶，phosphatidylinostiol 3′-OH kinase/ protein kinase B，PI3K /Akt)調控細胞凋亡研究較多。Akt在PI3K調控下激活后，通過多種途徑對細胞凋亡進行調控：①抑制NF-κB、FoxOs等轉錄因子的活性，調控凋亡；②磷酸化Bad、抑制caspase-9的磷酸化過程、抑制GSK-3活性，抑制凋亡；③抑制線粒體相關功能，抑制凋亡等[13]。FoxO1是FOX亞家族FoxO家族的一員，其磷酸化后會由細胞核轉移到細胞質中，與細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白結合，抑制細胞正常的周期、損傷修復及代謝活動，從而導致細胞周期停滯和凋亡[14-16]。IKK2為IKK的催化亞基[17]，是細胞因子介導的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化所必須的亞基結構[18]，而NF-κB在生物體內各種類型的細胞中均存在，對細胞的凋亡具有雙向調節(jié)作用。有研究證明IKK/NF-κB信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中對起著重要作用，在神經(jīng)細胞的凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[19]。

本實驗結果顯示：采用烙閉上鞏膜靜脈法[4]建立的SD大鼠慢性EIOP模型可以使大鼠IOP升高，且可維持至少8周(實驗結束時)，說明造模成功，且此法可以獲得較長、穩(wěn)定的高眼壓，與路雪婧等結果一致[20]；予以補精益視片后，SD大鼠慢性EIOP模型眼壓有所降低；造模后SD大鼠慢性EIOP模型初級視皮質促凋亡因子p-FoxO1及IKK2表達明顯升高，予以補精益視片后，SD大鼠慢性EIOP模型p-FoxO1及IKK2表達明顯降低。以上結果說明，補精益視片具有保護SD大鼠慢性EIOP模型視功能的作用，推測其機制可能為：降低IOP，減少初級視皮質p-FoxO1及IKK2表達。