某院耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥基因分析

周仕丹，劉春來，楊潤時，賈 玲，李 妍，曹海燕，晏輝鈞，孫 堅，莊志輝

(1. 惠州市中心人民醫院，廣東 惠州 516001； 2. 華南農業大學，廣東 廣州 510642； 3. 中山大學中山醫學院微生物學教研室 中山大學熱帶病防治研究教育部重點實驗室，廣東 廣州 510080)

近十年來，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)是全球密切關注的耐藥菌之一。2017年，世界衛生組織(WHO)[1]發布首份對抗菌藥物耐藥的“重點病原體”清單，列出對人類健康構成最大威脅的12種細菌，并根據這些細菌對新型抗菌藥物的迫切需求程度分成三個類別：極為重要、十分重要和中等重要，將CRE列入“極為重要”級別(1類重點)。CRE感染尚無有效的治療藥物，且病死率極高，給感染性疾病的治療帶來了嚴峻挑戰。近些年醫院CRE的分離率有所上升，故通過研究某院CRE的分子流行病學特點、感染危險因素等內容，為臨床醫生精準治療CRE感染患者和醫院感染管理部門防控CRE在醫院內的播散提供參考依據?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集某院2013—2017年細菌室-80℃醫用低溫箱保存的62株CRE(所有菌株的亞胺培南最小抑菌濃度≥4 μg/mL)，標本來自痰、尿、血、傷口分泌物等。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、DNA分子量標準、dNTP Mixture購于大連市寶生物工程有限公司,細菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生華科技有限公司,西班牙瓊脂糖購于北京市沃比森科技有限公司,6-磷酸葡萄糖購于廣州市普博欣生物有限公司,無水乙醇、氯化鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉購于廣州化學試劑廠。

1.3 主要設備 Ｖｉｔｅｋ ２ Ｃｏｍｐａｃｔ全自動微生物鑒定及藥敏分析儀、ＡＳＴ－ＧＮ１３藥敏卡購于法國梅里埃公司，超凈工作臺購于蘇州市凈化設備有限公司，ＤＮＰ－９２７２電熱恒溫培養箱購于上海市申賢恒溫設備廠，ＴＨＺ恒溫震蕩箱購于廣州市神化生物技術有限公司，Ｅｌｉｘ１００超純水裝置購于美國Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司，ＤＹＣＰ－３１Ｃ型電泳槽購于北京市六一儀器廠，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀購于日本島津公司，臺式高速離心機、微量移液器、電動移液槍購于德國Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，脈沖場凝膠電泳、電泳凝膠成像系統、ＰＣＲ擴增儀購于美國ＢＩＯ－ＲＡＤ公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株的初次分離、鑒定及保存 按照《全國檢驗技術操作規程(第4版)》[2]的要求進行接種、分離、培養,選擇有臨床意義的細菌，用法國梅里埃Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析儀進行細菌鑒定，使用AST-GN13藥敏卡進行MIC檢測。將血平板分純后的菌株，用脫脂棉簽刮洗下來，轉移至脫脂牛奶保存液，置于醫用低溫箱-80℃保存。

1.4.2 菌株的復活、再次鑒定 將-80℃保存的菌株接種到4 mL LB肉湯培養基，于37℃搖床中過夜培養；用接種環蘸取菌液，于美羅培南濃度為1 μg/mL的麥康凱瓊脂培養基上劃線，經37℃恒溫培養16～20 h。選用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(簡稱MALDI-TOF MS)技術和16S rDNA方法對分離的CRE進行菌株鑒定。

1.4.3 藥敏試驗 選取10種受試的抗菌藥物，根據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI) M100—S28(2018)[3]中藥物配置方法標準的指導，選取溶劑進行配制、稀釋，依照CLSI M100—S28(2018)中瓊脂稀釋法測定菌株的最小抑菌濃度(MIC)。藥敏試驗的判斷標準，除替加環素的折點(S≤1 μL/mL，R>2 μL/mL)、粘菌素的折點(S≤2 μL/mL，R>2 μL/mL)是參照歐洲藥敏試驗委員會(EUCAST)[4]推薦外，其余抗菌藥物的折點參照CLSI M100—S28(2018)文件的要求。見表1。

表1 CRE藥敏試驗的判斷標準(μL/mL)

1.4.4 全基因序列測定 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測細菌基因組。將所提基因組DNA送至諾和致源科技有限公司測序，采用細菌全基因組de novo測序技術，構建Illumina PE(400 bp)文庫，利用Illumina(Miseq/Hiseq)平臺測序，de novo組裝后進行生物信息分析。

1.4.5 序列結構分析 (1)菌株所攜帶質粒的分析：將拼接好的測序結果上傳至Plasmid Finder 1.3數據庫(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)。(2)菌株所含耐藥基因的分析：將拼接好的測序結果上傳至Res Finder 3.0數據庫(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)。

1.4.6 基因環境分析 對本試驗中大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌中攜帶的碳青霉烯耐藥基因進行基因環境分析。將待分析菌株的全基因測序結果應用Mauve軟件與參考序列進行比對，找出耐藥基因所在重疊群(Contig或Scaffold)，進行Blast比對，找出與待分析菌株相似的菌株基因環境，用Snap Gene軟件進行序列比對，最后用Easyfig軟件畫出相應的基因環境圖，用Adobe Illustrator CC進行圖片編輯，最終得到待測菌株的基因環境圖。

1.4.7 多位點序列分型(MLST) (1) ST分型：將拼接好的進行全基因組測序菌株的測序結果上傳至pMLST 1.4數據庫(https://cge.cbs.dtu.dk/services/pMLST/)，分析其所屬ST型。(2)新的ST型上傳：將疑似新的ST型的全基因組測序結果提交至Acinetobacter baumannii MLST數據庫(https://pubmlst.org/abaumannii/submission.shtml)以獲得新的ST型。

1.5 質控菌株 大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 8739為華南農業大學實驗室保存菌株。

2 結果

2.1 細菌的鑒定與MLST結果 共收集62株CRE，成功復活51株，經細菌鑒定均為腸桿菌科細菌；11株CRE未復活，主要是菌株留存年限較遠。成功復活的51株CRE中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)30株, 耐碳青霉烯類大腸埃希菌(carbapenem-resistantEscherichiacoli，CREC)9株,耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobactercloacae，CRECL)6株，其他CRE 6株。CRKP MLST主要包括3株ST147、2株ST11；CREC MLST主要包括3株ST167；CRECL MLST主要包括3株ST93、2株ST88。見表2。

2.2 藥敏試驗結果 51株CRE對AMP、CTX的耐藥率最高，均為100%；其次是MEM、SXT，均為96.08%。見表3。

2.3 全基因測序結果 35株(68.63%)CRE攜帶一種耐碳青霉烯類的耐藥基因，15株(29.41%)CRE同時攜帶兩種或兩種以上耐碳青霉烯類的耐藥基因；1株未檢出耐碳青霉烯類的耐藥基因，但檢出多種耐其他抗菌藥物的基因。51株CRE檢出的耐碳青霉烯類耐藥基因分布情況為1株攜帶blaKPC-2，14株攜帶blaIMP-4，18株攜帶blaNDM-1，22株攜帶blaNDM-5，2株攜帶blaNDM-9，10株攜帶blaOXA-1，10株攜帶blaOXA-10，2株攜帶blaOXA-23，2株攜帶blaOXA-66。51株CRE主要抗菌藥物耐藥基因檢出陽性率依次為四環素耐藥基因(tet，94.12%)、甲氧芐氨嘧啶耐藥基因(dfrA，90.20%)、β-內酰胺酶基因(blaTEM，88.24%)。見圖1。

2.4 菌株的基因環境分析結果 由于本研究中所檢出的OXA基因亞型(blaOXA-1、blaOXA-10、blaOXA-23、blaOXA-66)位于染色體上的可能性較大，未發現全球廣泛散播的blaOXA-48-like型，因此，只分析攜帶blaNDM-1、blaNDM-5、blaNDM-9、blaIMP-4的菌株基因環境。

2.4.1blaNDM-1基因環境分析 選取攜帶blaNDM-1基因不同菌種的肺炎克雷伯菌(4A5和4G5)、大腸埃希菌(3D6)、弗勞地檸檬酸桿菌(3G6)、黏質沙雷菌(4E6)的全基因測序結果進行基因環境分析，發現4G5、3G6、4A5、4E6的blaNDM-1基因位于13 524 bp的DNA片段上。進一步比對發現4G5與pNDM-HN380-IncX3的基因環境完全相同，在blaNDM-1的上游均是被IS5截斷的ISAba125，而下游在insE被IS26所截斷；而4A5則比pNDM-HN380少了一段被IS5截斷的ISAba125的上游。經測序后顯示4株(4G5、3G6、4A5、4E6)攜帶blaNDM-1菌株的基因環境見圖2a。3D6菌株的基因環境則與存在于pNDM-KN-IncA/C上的基因環境相似，相比于質粒pNDM-KN，3D6缺失一段長度為18 885 bp包含有Tn7轉座子的堿基序列，見圖2b。

表2 51株CRE的MLST結果

注：部分標本在分離的時候，若存在不同形態的菌株，會分離出不同標本，例如，4C1-1、4C1-2為標本號4C1分離的菌株，若鑒定結果為同種細菌，則匯總時用標本號；若為不同細菌，則以菌株分離的編號為準；若無法鑒定，則不納入分析；UK表示型號未知

表351株CRE的藥敏結果

Table3Antimicrobial susceptibility testing results of 51 strains of CRE

抗菌藥物敏感率(%)中介率(%)耐藥率(%)AMP0.000.00100.00CTX0.000.00100.00MEM1.961.9696.08CS78.430.0021.57TIG72.550.0027.45GEN25.493.9270.59AMK62.753.9233.33FOS47.0613.7239.22CIP3.923.9292.16SXT3.920.0096.08

圖1 51株CRE主要抗菌藥物耐藥基因檢出情況

注：圖a中4E6的基因環境為4G5上兩個綠色標記的區間內的基因環境，3G6的基因環境為4A5上兩個橙黃色標記的區間內的基因環境；圖b是3D6的基因環境

圖2攜帶blaNDM-1的菌株基因環境

Figure2Genetic environment of strains carryingblaNDM-1

2.4.2blaNDM-5基因環境分析 選取攜帶blaNDM-5基因不同菌種的肺炎克雷伯菌(4A4)、陰溝腸桿菌(4H2)、大腸埃希菌(4H5)、解鳥氨酸烏拉爾菌(5A6)的全基因測序結果進行基因環境分析，發現4H2與4H5的基因環境與質粒pNDM-IncX3的pir-dnaJ之間的序列相同，其blaNDM-5基因均位于45.594 kb的DNA序列上；blaNDM-5的上游是被IS5截斷的ISAba125，下游在cutA1處被IS26所截斷。而菌株4A4與5A6的基因也與pNDM-IncX3相同，分別為3 122 bp和3 502 bp的DNA序列，不過位于截斷的IS26和ISAba125之間。經測序后顯示4株攜帶blaNDM-5菌株的基因環境見圖3。

注：4A4的基因環境為4H2上兩個綠色標記的區間內的基因環境；5A6的基因環境為4H2上兩個橙黃色標記的區間內的基因環境

2.4.3blaNDM-9基因環境分析 選取攜帶blaNDM-9基因的肺炎克雷伯菌(3H4-2)的全基因測序結果進行基因環境分析，發現blaNDM-9的基因環境與pNDM-HN380的基因環境基本相同，位于50 156 bp的DNA片段上，與blaNDM-1(4G5)不同的是blaNDM-9的上游是完整的ISAba125，而不是被IS5截斷的，下游在insE下游被IS26所截斷，且3H4-2比pNDM-HN380少了一段IS26-blaSHV-12-ygbI-ygbJ-IS26的DNA序列。見圖4。

圖4 攜帶blaNDM-9的菌株基因環境

2.4.4blaIMP-4基因環境分析 選取攜帶blaIMP-4基因不同菌種的肺炎克雷伯菌(4A4)、陰溝腸桿菌(3B3)、雷氏普羅威登斯菌(5B1)的全基因測序結果進行基因環境分析，發現4A4基因環境與KP 3 IMP的基因環境完全相同，位于3 777 bp的DNA拼接片段上，其DNA片段的catB3被IS26截斷，IS26也只有127 bp堿基殘留，見圖5a。5B1的基因環境與質粒pPrY2001較相似，blaIMP-4兩端為ISCR1以及Tn1337轉座子插入序列的13 102 bp的DNA片段上，見圖5b。

圖a：4A4的基因環境；圖b：3B3、5B1的基因環境

3 討論

2012—2018年，該院CRE總體檢出率為1.25%(229/18 270)，CRE的檢出率呈逐年增加的趨勢。7年共檢出229株CRE，檢出居前3位的依次為CRKP(74株)、CREC(48株)、CRECL(45株)，與2017年CHINET[5]全國調查結果一致。

本研究結果顯示，CRE菌株對多種抗菌藥物均表現出多重耐藥的現象，但未檢測聯合用藥后細菌的耐藥情況?！稄V泛耐藥革蘭陰性菌感染的實驗診斷、抗菌治療及醫院感染控制：中國專家共識》[6]指出，碳青霉烯類與磷霉素、多粘菌素、替加環素、利福平等聯合治療CRE感染的臨床療效，要優于單藥或其他聯合用藥方案；碳青霉烯類抗生素用于治療CRE感染要符合三方面的條件：(1)MIC≤8 mg/L；(2)大劑量給藥(如美羅培南2 g q8h)；(3)延長每劑靜脈滴注時間至2～3 h。此外，臨床醫生要嚴格掌握碳青霉烯類抗生素的臨床應用適應證。全國抗菌藥物臨床應用監測網數據顯示，碳青霉烯類抗生素使用強度由2011年的1.83 DDDs/100人·天上升至2017年的3.28 DDDs/100人·天。臨床碳青霉烯類抗生素使用量的增加，除與多重耐藥菌(MDRO)感染、免疫缺陷/免疫抑制的患者增多外，還與部分臨床醫生不合理使用抗菌藥物有關。因此，明確為MDRO重癥患者才能使用碳青霉烯類抗生素，且用藥前應送檢標本，明確病原體與藥敏情況后，再結合患者病情合理降階梯治療[7]。

本研究MLST結果顯示，CRKP中包含9種不同的ST型，其中ST147和ST11較流行。來自匈牙利2005年的研究[8]推測，ST11和ST147可能是導致blaCTX-M基因散播的重要克隆群。隨后相關研究[9-10]表明，產ESBLs肺炎克雷伯菌造成的醫院感染中，ST11和ST147是主要的克隆群。雖然ST11常被認為是blaKPC基因散播的主要國際流行株，而在2009年首次發現新型碳青霉烯酶NDM后[11]，這兩個克隆群攜帶blaNDM基因在全球頻繁被報道[12-14]。研究[15]顯示，ST147可能是由中東地區傳播至歐洲。中國Wang等[16]2011—2012年從11省13所醫院獲得的1 870株腸桿菌科細菌中，發現3株產NDM-1肺炎克雷伯菌，均屬于ST147型。CREC中ST167較流行，該序列型在國際上檢出較少，僅在歐洲少量檢出[17]，我國最早在2013年于1例男性患者的直腸拭子標本中分離到1株產NDM-5的大腸埃希菌，屬于ST167型，之后常于我國臨床檢出[18-20]。所檢出的CRECL分型屬于ST93和ST88，分別攜帶blaIMP-4和blaNDM-1；ST93在國際和國內的報道較多，美國[21]、南非[22]、波蘭[23]均有該序列型的報道；Jin等[24]2012—2016年間對來自我國11個城市12所醫院的55株CRECL研究發現，ST93是第二流行的克隆群，僅次于ST418，且來源于國內的多個城市；而Jia等[25]2012—2016年對我國西南地區兩所醫院的1 146株陰溝腸桿菌研究顯示，ST88是最常見的CRECL序列型，其次為ST9。

通過對攜帶blaNDM-1、blaNDM-5、blaNDM-9、blaIMP-4不同菌種的基因環境進行分析，發現幾種耐藥基因各自的基因環境都與已報道的基因環境相似，無明顯的菌種間差異性，說明耐藥基因通過水平傳播能夠穩定存在于不同的菌種之間，對醫院感染預防與控制造成更大的威脅。

在我國，關于blaNDM基因的早期報道多來源于不動桿菌屬細菌，且常位于不可分型的質粒上[26-27]，隨后blaNDM基因所在的Tn125轉座子從不動桿菌屬細菌中轉移到腸桿菌科細菌中[28]，且位于約50 kb大小的不可分型質粒上，且能夠發生跨種屬傳播。而隨后該基因位于IncX3型質粒上的研究更是時有報道且呈逐年增多的趨勢。在本研究中，blaNDM-5、blaNDM-1和blaNDM-9位于相似的基因環境中，即耐藥基因的上游存在插入序列ISAba125，區別在于blaNDM-1和blaNDM-5中被IS5所截斷，而在blaNDM-9中則是完整的；而下游則是被插入序列IS26所截斷，區別在于blaNDM-5在cutA1處被IS26所截斷，而blaNDM-1和blaNDM-9則是在insE下游被IS26所截斷。已有研究[29]表明，pNDM-HN380可能是這種基因環境的先祖質粒，值得關注的是在本研究中的18株blaNDM-1和2株blaNDM-9所在的基因環境均與其高度相似，表明這種基因環境傳播較為廣泛。而在這種基因環境的基礎上，插入位點的改變形成了blaNDM-5所在基因環境，意味著插入序列所介導的基因環境的變化始終隨著時間或外界壓力的變化而不斷進化。

blaIMP-4基因首次報道[30]分離自香港某醫院重癥監護病房的不動桿菌屬細菌，并隨后在廣東某醫院1例下肢潰瘍患者分離的弗勞地檸檬酸桿菌中檢出[31]，截至目前，blaIMP-4基因已經被證實存在于多種革蘭陰性菌中，常位于IncL/M和IncA/C型質粒上。本研究中4株不同菌種所攜帶blaIMP-4基因都存在于blaIMP-4-qacG2-aacA4-catB3的基因盒中，此環境與最初報道于廣東某醫院的環境相同，且在世界范圍內都有較多報道[32-33]，說明I型整合子在blaIMP-4的散播過程中起到了重要的作用。

研究[34]表明，造成CRE傳播、定植或感染的危險因素主要有患者本身嚴重的基礎疾病、頻繁轉科或者更換床位、侵襲性診療操作、廣譜抗菌藥物的使用。因此，CRE的感控管理是一項復雜的系統工程，其傳播及感染的危險因素多，且存在交叉影響，任何一個預防控制環節的疏漏，隔離防控措施不到位，均可能導致CRE醫院感染的傳播，甚至流行和暴發。

致謝：感謝廣東省醫院感染質量控制中心主任，國家醫院感染管理專業質控中心專家委員會委員，廣東省醫學科學院，廣東省人民醫院侯鐵英教授對本研究提出的寶貴意見。