ATXN1基因內CAG重復序列拷貝數增加對神經母細胞瘤細胞增殖與凋亡的影響

陳詩愷，孫順昌

(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院，上海 201801)

遺傳性脊髓小腦型共濟失調(SCA)是一組臨床和遺傳均具異質性的神經系統退行性疾病，主要臨床表現為小腦性共濟失調，可伴有構音障礙、意向性震顫、眼肌麻痹等癥狀[1]。SCA遺傳模式以常染色體顯性遺傳為主，亦有常染色體隱性遺傳和X-連鎖隱性遺傳等模式。從遺傳學上可將SCA分為30多型，大部分型SCA致病基因已被克隆[2]。序列分析顯示部分型SCA具有共同的基因突變特征，即由基因編碼內的CAG序列重復數過多而引起，故這類SCA統稱為多聚谷氨酰胺遺傳性脊髓小腦型共濟失調(PolyQ SCA)[3]。PolyQ SCA具有遺傳早現現象，且CAG序列重復數會在親子傳遞中發生變化，多數CAG序列重復數隨父系遺傳而增加，隨母系遺傳而減少[4]。SCA病理機制仍不完全清楚，其發病與突變產物的堆積有關，但在動物體內正常基因的過度表達亦可產生SCA癥狀[5]。2018年3～11月，本研究通過構建正常和突變的ATXN1基因，探討ATXN1基因內CAG序列重復拷貝數增加對人胚腎293T細胞增殖能力和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎細胞(293T細胞)和感受態大腸桿菌細胞(Stbl3細胞)購自廣州輝駿生物技術有限公司。DMEM細胞培養液、胎牛血清及胰酶購自Gibco公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和CCK8購自上海碧云天公司。T4 DNA連接酶購自賽默飛公司，BC117125.1克隆質粒和pLVX-Puro-3xflag-SBPtag2-C載體、pMD2.G及psPAX2購自廣州輝駿生物技術有限公司，AXTN1-MUT基因由廣州輝駿生物技術有限公司合成。超凈工作臺(SW-CJ-2FD型)和生物安全柜(BHC-1300IIA/B3型)購自蘇靜集團有限公司，二氧化碳培養箱(3111型)和低溫冷凍離心機(ST16R型)購自賽默飛公司。倒置顯微鏡(MF51型)購自廣州明美光電有限公司，流式細胞儀(Guava EasyCyte型)購自Millpore公司，酶標儀(318CT)購自上海沛歐公司。

1.2 pLVX-Puro-3xflag-AXTN1表達載體構建 以BC117125.1克隆質粒為模板擴增正常ATXN1基因，人工合成突變AXTN1基因。回收擴增的目的片段AXTN1-WT和AXTN1-MUT，再用核酸內切酶EcoRI和XbaI進行雙酶切，最后用T4 DNA連接酶接到pLVX-Puro-3xflag-C載體上，構建成pLVX-Puro-3xflag-AXTN1表達載體。

1.3 表達載體鑒定 將構建的pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT和pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT表達載體分別導入感受態Stbl3細胞中進行克隆，收集菌液，抽提質粒。通過EcoRI和XbaI雙酶切及測序鑒定構建的pLVX-Puro-3xflag-AXTN1表達載體。

1.4 AXTN1穩轉細胞株的篩選及表達鑒定 將包裝質粒和經鑒定構建正確的pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT或pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT表達載體質粒共轉染293T細胞，產生假慢病毒顆粒，通過超速離心法純化假慢病毒顆粒。在polybrene作用下，用假慢病毒顆粒感染293T細胞，用puromycin篩選AXTN1穩轉細胞株，通過Western blotting法鑒定表達載體表達正常的AXTN1蛋白和突變AXTN1蛋白。將培養的穩轉細胞株進行細胞增殖與凋亡實驗。

1.5 細胞增殖能力檢測 將表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT載體、表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT載體、轉染pLVX-Puro-3xflag-C載體(陰性對照)的293T細胞分別接種至96孔培養板中，每株設定4個復孔，每孔細胞數為1×104個，分別培養1～5 d。測定前4 h每孔加入1/10體積CCK-8溶液孵育4 h后，酶標儀讀取OD450值。

1.6 細胞凋亡率測算 培養293T穩轉細胞株5 d后，將培養板中的培養基移至清潔的15 mL離心管中并置于冰上(保留已脫落的凋亡細胞)；培養板上的細胞先用PBS溶液洗凈，然后用0.25%胰酶消化培養板，使細胞脫落，收集于冰上保留的原細胞培養液中；用PBS溶液洗凈脫落細胞，用結合緩沖液制成500 μL 濃度為2×105/mL細胞懸液，再加入5 μL Annexin V-FITC混勻，最后加入Propidium lodide 5 μL混勻，室溫避光反應15 min。用流式細胞儀(millpore, Guava EasyCyte)測定凋亡細胞百分率。

1.7 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件。不同載體細胞增殖能力比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 293T細胞中AXTN1蛋白表達 通過慢病毒載體介導，293T細胞中成功表達出正常AXTN1蛋白和突變AXTN1蛋白，見圖1。

注：MW：蛋白相對分子質量標記；NC：轉染pLVX-Puro-3xflag-C載體的細胞；MUT：表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT載體的細胞；WT：表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT載體的細胞。

圖1 293T細胞中AXTN1蛋白表達

2.2 不同載體細胞增殖能力比較 表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT載體的細胞在培養3～5 d，細胞的OD450值均低于表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT載體的細胞和只轉染pLVX-Puro-3xflag-C載體的陰性對照細胞(P均<0.01)，而表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT載體的細胞和只轉染pLVX-Puro-3xflag-C載體的陰性對照細胞在培養3～5 d的OD450值差異無統計學意義(P>0.05)。同表達正常ATXN1基因的293T細胞相比，表達突變ATXN1基因的293T細胞增殖能力下降(P<0.01)。見表1。

表1 不同載體細胞的OD450值比較

2.3 細胞凋亡率比較 培養細胞5 d后，陰性對照細胞的凋亡率為8.17%，表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT(正常ATXN1基因)載體的細胞凋亡率為9.06%，而表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT載體(突變ATXN1基因)的細胞凋亡率為12.56%。表達突變ATXN1基因的293T細胞凋亡率高于表達正常ATXN1基因的293T細胞(P<0.01)，而表達正常ATXN1基因的293T細胞與轉染陰性質粒293T細胞的凋亡率差異無統計學意義。見圖2。

注：A：轉染pLVX-Puro-3xflag-C載體的293T細胞；B：表達pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT載體的293T細胞；C：pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT載體的293T細胞。

圖2 細胞凋亡的流式分析

3 討論

部分神經退行性疾病的重要分子病理特征是基因編碼區的CAG重復序列擴增超出正常范圍，導致編碼蛋白含超出正常長度的多聚谷氨酰胺序列，這些蛋白會出現錯誤折疊，產生蛋白聚體沉積在胞質或胞核內，這類疾病亦稱PolyQ病[6]。常見的PolyQ病有遺傳性脊髓小腦型共濟失調、Huntington舞蹈病等[7]。遺傳性脊髓小腦型共濟失調中屬于PolyQ病的型：SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12、SCA17和齒狀肌麻痹性萎縮(DRPLA)[8]。SCA1是ATXN1基因突變所致，ATXN1基因定位于染色體6p23，含7個外顯子，其中外顯子7含一段CAG重復序列，正常人重復數在7～38，SCA1患者的重復數在39～82[9]。CAG重復序列擴增導致神經元退行性改變的詳細機制尚不清楚，但研究已發現了部分病變的分子基礎[10]。敲除ATXN1基因的小鼠并未出現SCA1癥狀，提示ATXN1基因功能丟失并非SCA1發病的首要原因，但缺乏ATXN1蛋白可能會通過轉錄下調、蛋白相互作用減弱等機制影響神經元功能[11]。研究發現，突變ATXN1蛋白轉位到細胞核內亦是SCA1發病的重要因素[12]。因此SCA1發病既有ATXN1突變蛋白的毒性作用，亦有正常ATXN1蛋白功能缺失的影響。本研究構建含正常和突變ATXN1基因的慢病毒表達載體，分析突變ATXN1蛋白對293T細胞增殖和凋亡的影響，以探討SCA1發病的分子機制。

研究顯示，SCA1發病的年齡與ATXN1基因內CAG重復序列長度呈負相關，CAG重復序列長度越長，其發病年齡越小。目前已報道的患者CAG重復序列最長達82次[13]。我們診斷的一個SCA1家系中先證者CAG重復序列長達61次，患者于18歲發病，首發癥狀為步態不穩，行走緩慢，24歲就診時，出現意向性震顫、構音障礙、吞咽困難、腱反射亢進等癥狀，核磁共振檢查顯示小腦和腦干萎縮。該家系通過PCR及測序被診斷為SCA1家系。因此本研究構建的ATXN1突變基因含61次CAG重復序列。通過慢病毒載體介導，本研究在293T細胞中成功表達出正常和突變的ATXN1蛋白。

CCK8實驗結果顯示，導入突變AXTN1基因的細胞的增殖能力從第3天開始低于導入正常AXTN1基因的細胞，差異有統計學意義。細胞增殖實驗結果顯示，表達突變ATXN1基因的293T細胞增殖能力下降，差異有統計學意義，提示ATXN1基因內CAG重復序列拷貝數增加可抑制細胞的增殖能力，其機制有待進一步研究。SCA屬于一種中樞神經系統退行性疾病，其病理表現為小腦浦肯野細胞丟失，丟失的原因可能為壞死性凋亡[14]。通過流式細胞儀測定培養5 d后的293T細胞的凋亡率發現，表達突變AXTN1蛋白的細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均高于表達正常AXTN1蛋白的細胞，提示突變AXTN1蛋白的表達促進了細胞凋亡，與SCA1患者的神經退行性改變相符。AXTN1基因內CAG重復序列變異導致細胞的增殖與凋亡能力改變可能是引起SCA1的病理機制之一。

綜上所述，ATXN1基因內CAG重復序列拷貝數增加可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，CAG重復序列變異導致細胞的增殖與凋亡能力改變可能是引起SCA1的病理機制之一。