促紅細(xì)胞生成素對(duì)缺氧誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

熊建文，謝兆豐，江志忠，張建興，鄧偉，張利洪，張智偉

(1南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，廣州510900；2廣東省人民醫(yī)院心血管病研究所)

促紅細(xì)胞生成素(EPO)是紅系細(xì)胞增生、分化及凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究[1]發(fā)現(xiàn)，其對(duì)缺血再灌注損傷時(shí)的神經(jīng)元有減少細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。另有研究[2]表明，轉(zhuǎn)錄因子GATA-4在減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用 。PI3K-Akt信號(hào)通路介導(dǎo)多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[3]，為促肝細(xì)胞癌發(fā)生的分子機(jī)制之一[4]。腫瘤發(fā)生的機(jī)制主要為某組織出現(xiàn)失控的病理性增殖，生理性凋亡被重度抑制[5]。我們認(rèn)為其促腫瘤效應(yīng)通過(guò)PI3K/Akt途徑激活、上調(diào)，發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)實(shí)現(xiàn)。這種分子機(jī)制的上調(diào)在心肌細(xì)胞缺氧情況下是否發(fā)揮保護(hù)作用尚不清楚。EPO是否對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路產(chǎn)生影響及進(jìn)一步影響心肌細(xì)胞凋亡，目前尚不明確。2018年3～8月，本實(shí)驗(yàn)擬建立缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)比色法和細(xì)胞流式法測(cè)定EPO或LY294002(PI3K特異性抑制劑)或IGF-1(PI3K特異性激活劑)干預(yù)下的肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)活力、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)陽(yáng)性表達(dá)率和細(xì)胞凋亡率的變化，明確EPO能否影響缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)探討凋亡的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 新生1～3 d的雄性SD大鼠15只[南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵))2007-0006]，體質(zhì)量約300 g；重組促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)購(gòu)自以色列ProSpec-Tany TechnoGene Ltd公司；肌酸激酶(CK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自Sigma公司；CO2培養(yǎng)箱(Shellab 2306和Shellab 2323型，USA)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(USA)。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)聯(lián)合碘化丙啶(PI)染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Yeasen公司。

1.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 無(wú)菌操作取出新生大鼠的心室肌組織，磷酸緩沖液(PBS)沖洗并剪碎，組織胰酶消化法分離細(xì)胞，差速貼壁法和BrdU化學(xué)抑制法純化。用20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，并以1×109/L濃度接種至培養(yǎng)瓶中。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)1～2 h,吸出細(xì)胞懸液,再接種至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),每2～3 d換液,待細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積的80%時(shí)傳代。

1.3 缺氧模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)前24 h按1×1010/L濃度接種至培養(yǎng)瓶中更換成無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h后將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)至厭氧培養(yǎng)箱中，抽真空至0.1 mPa，以95%N2、5%CO2填充，培養(yǎng)3 h后即為缺氧新生大鼠心肌細(xì)胞模型，并移至CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)1 h。設(shè)立正常對(duì)照組、缺氧組及低、中、高EPO干預(yù)組、LY294002干預(yù)組、IGF-1干預(yù)組共7組，正常對(duì)照組于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不經(jīng)缺氧處理或藥物干預(yù)。缺氧組細(xì)胞經(jīng)缺氧處理，不予任何藥物干預(yù)。低EPO干預(yù)組：以6.25 IU/mL的EPO預(yù)處理細(xì)胞24 h,再予缺氧處理。中EPO干預(yù)組：以25 IU/mL的EPO預(yù)處理細(xì)胞24 h,再予缺氧處理。高EPO干預(yù)組：以100 IU/mL的EPO預(yù)處理細(xì)胞24 h,再予缺氧處理。LY294002干預(yù)組：以L(fǎng)Y294002(終濃度50 μmol/L)預(yù)處理1 h，后予缺氧處理。IGF-1干預(yù)組：以IGF-1(200 ng/mL)預(yù)處理細(xì)胞1 h,后予缺氧處理。

1.4 LDH、CK活力測(cè)定 采用比色法。細(xì)胞培養(yǎng)并分組干預(yù)結(jié)束后，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)步驟收集細(xì)胞、處理檢測(cè)樣品，獲得細(xì)胞上清液。最后用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定光密度(OD)值，計(jì)算CK、LDH的活力。

1.5 Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。完成細(xì)胞培養(yǎng)并分組干預(yù)處理，胰酶消化后離心,1 000 r/min，5 min,收集細(xì)胞，棄上清液，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管中，然后進(jìn)行以下操作：①用預(yù)冷的PBS洗2次；②細(xì)胞沉淀中加入300 L洗滌緩沖液，然后加入Caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK 1 L，搖勻后置37 ℃、5% CO2孵箱中孵育30 min；③3 000 r/min，離心5 min，棄上清液，留用細(xì)胞沉淀，0.5 mL洗滌緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，再次離心棄上清液，留細(xì)胞沉淀，進(jìn)行2次0.5 mL洗滌緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用Multicycle軟件分析Caspase-3表達(dá)。

1.6 心肌細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測(cè)。完成干預(yù)培養(yǎng)后，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1 000 r/min,離心5 min,收集細(xì)胞，棄上清液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管中，繼續(xù)以下操作：①用預(yù)冷的PBS(pH7.4)將細(xì)胞沉淀離心(800 r/min,5 min)洗滌2次；②加入100 μL Binding緩沖液和FITC-Annexin V(20 μg/mL)10 μL,室溫避光靜置30 min；③加入PI(50 μg/mL)5 μL，避光反應(yīng)5 min，加入400 μL Binding緩沖液。最后以FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞上清液中CK、LDH活力比較 經(jīng)EPO預(yù)處理，缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞CK、LDH活力降低，呈劑量依賴(lài)性，低EPO干預(yù)組、中EPO干預(yù)組、高EPO干預(yù)組組間CK、LDH活力比較，P均<0.01；各組心肌細(xì)胞上清液中CK、LDH活力比較見(jiàn)表1。

表1 各組心肌細(xì)胞上清液中CK、LDH活力比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與缺氧組比較，#P<0.01；與LY294002干預(yù)組比較，cP<0.01。

2.2 各組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率比較 正常對(duì)照組、缺氧組、低、中、高EPO干預(yù)組、LY294002干預(yù)組及IGF-1干預(yù)組Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為1.093±0.742、48.933±3.109、45.667±6.646、13.650±4.455、3.360±0.415、84.683±6.806、3.470±0.402，缺氧組Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于正常對(duì)照組(P<0.01)。低、中、高EPO干預(yù)組Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均低于缺氧組(P均<0.01)，低、中、高EPO干預(yù)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 正常對(duì)照組、缺氧組、低、中、高EPO干預(yù)組、LY294002干預(yù)組及IGF-1干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡率分別為0.63%±0.1%、35.6%±1.3%、22.4%±2.1%、12.9%±2.3%、5.39%±1.1%、83.5%±2.1%、5.01%±1.1%，各組間比較，P均<0.01。

3 討論

凋亡造成心肌細(xì)胞減少是人類(lèi)多種心臟疾病的重要原因，如缺血性心肌病等[6]。凋亡為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，但凋亡發(fā)展至晚期階段，其表現(xiàn)類(lèi)似于細(xì)胞壞死。CK、LDH是位于細(xì)胞內(nèi)的酶類(lèi)，在凋亡晚期階段，細(xì)胞膜破壞時(shí)釋放至細(xì)胞外而被檢測(cè)到，而心肌細(xì)胞富含CK、LDH。即使在臨床實(shí)踐中，比色法檢測(cè)CK、LDH活力，亦是評(píng)估心肌細(xì)胞壞死的重要方法。

凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的、由Caspases家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，不同的啟動(dòng)性Caspases介導(dǎo)不同的凋亡信號(hào)。效應(yīng)性Caspases激活后主要從以下幾方面導(dǎo)致細(xì)胞凋亡：①激活凋亡特異性核酸酶，水解DNA導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生；②降解細(xì)胞骨架蛋白；③裂解DNA修復(fù)的關(guān)鍵酶-多聚ADP核糖多聚酶等。正常細(xì)胞中Caspase-3以酶原形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段被激活，活化的 Caspase-3由兩個(gè)大小亞基組成, 裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)是當(dāng)今研究細(xì)胞凋亡的主流方法之一。因此，Caspase-3常被作為細(xì)胞凋亡的早期檢測(cè)指標(biāo)。

在眾多檢測(cè)細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)方法中，Annexin V /PI法是目前較為流行的檢測(cè)方法。細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)中內(nèi)層的磷脂酰絲氨酸外翻，暴露于細(xì)胞膜表面。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。PI是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI能透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。PI 被排除在活細(xì)胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC- Annexin V 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性(Annexin V+/PI+)。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此，因此Annexin V/PI法是目前較為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法。其缺點(diǎn)是細(xì)胞膜的改變持續(xù)時(shí)間有限，選擇檢測(cè)的時(shí)機(jī)較重要[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EPO預(yù)處理可減輕缺氧誘導(dǎo)的CK、LDH酶的活力，降低細(xì)胞Caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)率及Annexin V/PI法細(xì)胞凋亡率。CK、LDH作為心肌細(xì)胞壞死標(biāo)志物，Caspase-3作為作為細(xì)胞凋亡指標(biāo)，干預(yù)后上述指標(biāo)均下降，且這種保護(hù)作用呈劑量相關(guān)性，證明EPO具有保護(hù)心肌細(xì)胞、減輕心肌細(xì)胞凋亡、抑制缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的作用。EPO干預(yù)后，Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率和細(xì)胞凋亡率明顯下降，進(jìn)一步提示EPO具有抗細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。Yamanaka 等[8]夾閉脊髓的供血?jiǎng)用}4 min，建立脊髓缺血性損傷動(dòng)物模型，注射EPO干預(yù)，結(jié)果提示EPO有協(xié)同二氮嗪減輕凋亡作用。另一項(xiàng)研究表明，EPO對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)的SD大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制為減輕海馬神經(jīng)元的凋亡[9]。上述研究結(jié)果均提示EPO在不同組織細(xì)胞中均有抗凋亡、減輕缺血、缺氧損傷作用。本研究結(jié)果顯示，EPO對(duì)心肌細(xì)胞有抑制凋亡、減少缺氧損傷的效應(yīng)。EPO促紅系細(xì)胞生成分化、組織保護(hù)等多種作用通過(guò)與不同受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)。Leist等[10]研究發(fā)現(xiàn)，EPO的某些衍生物(如甲氨?；疎PO)或突變體不與經(jīng)典的EPO受體結(jié)合，在動(dòng)物體內(nèi)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有與EPO同等的細(xì)胞保護(hù)效力，但無(wú)促造血系統(tǒng)的作用。EPO促進(jìn)紅系細(xì)胞增殖、分化的作用廣泛用于腎性貧血患者。近來(lái)年，EPO紅系細(xì)胞外的機(jī)體保護(hù)作用逐漸受到重視，但多數(shù)研究均集中于EPO對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)方面。與目前已有研究不同，本研究將EPO保護(hù)機(jī)制探索領(lǐng)域轉(zhuǎn)移到心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理可加重缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡；PI3K特異性激活劑IGF-1預(yù)處理可抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。提示PI3K/Akt信號(hào)途徑活化可抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，PI3K/Akt信號(hào)途徑參與了缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制。在EPO對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[11]、神經(jīng)元[12]保護(hù)作用研究中，ERK磷酸化介導(dǎo)EPO對(duì)細(xì)胞生存信號(hào)通路的促進(jìn)，在EPO的保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。EPO的細(xì)胞保護(hù)作用還與維持線(xiàn)粒體跨膜電位有關(guān)[13]。如果檢測(cè)線(xiàn)粒體跨膜電位將有助于了解EPO在本實(shí)驗(yàn)對(duì)線(xiàn)粒體穩(wěn)定的影響。Chong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，EPO對(duì)暴露于高糖中的血管內(nèi)皮細(xì)胞有顯著保護(hù)作用。這些實(shí)驗(yàn)使用不同細(xì)胞及誘導(dǎo)物，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，EPO具有抗炎、抗過(guò)氧化、抗凋亡、促血管生成作用，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，EPO可抑制缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)途徑有關(guān)。但本研究未能對(duì)PI3K蛋白表達(dá)和pAkt蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)是本實(shí)驗(yàn)的局限之一。