過表達SIRT1對脊神經結扎大鼠病理性疼痛的影響及機制

華雷，周外平，李夢杰

(武漢市第四醫院，武漢 430033)

神經病理性疼痛屬于慢性疼痛，一般表現為自發性疼痛、痛覺異常以及痛覺過敏[1]。細胞沉默信息調節因子1(SIRT1)具有較強的去乙酰化作用，主要參與糖脂代謝、細胞周期調控、細胞凋亡等生理過程。研究表明，SIRT1抑制劑能加速足部甲醛炎癥疼痛，而激活SIRT1表達后可降低足部炎癥疼痛[2,3]。體外SIRT1過表達可減輕內毒素所致神經元軸突變性，緩解脊髓疼痛[4]。然而關于SIRT1抑制神經性疼痛機制目前研究不多。本研究通過制備脊神經結扎(SNL)模型，經鞘內注射過表達SIRT1載體，探究其對大鼠病理性疼痛及神經元凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠54只，8周齡，體質量220～260 g，購于河南省動物實驗中心，許可證號：SYXK(豫)2016-0002。所有大鼠在統一環境內飼養，室內溫度25 ℃，相對濕度45%～60%，晝夜交替12 h，自由攝食、飲水，嚴格遵循國家動物飼養規則，動物疼痛實驗經本院動物倫理委員會批準同意。兔抗鼠SIRT1、乙酰化組蛋白H3(Ac-H3)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin、山羊抗兔二抗(博奧森生物科技有限公司)、pAd/PL腺病毒載體(Invitrogen公司，美國)，免疫熒光顯微鏡、垂直電泳儀(Bio-Rad公司，美國)，鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒(Simga公司，美國)；蛋白提取試劑盒、BCA檢測試劑盒(索萊寶科技有限公司，中國)；機械痛閾測量儀及熱輻射痛閾檢測儀(UGO BASILE公司，意大利)，透射電鏡(Tecnai公司，荷蘭)。

1.2 模型制備及分組 大鼠均經腹腔注射2%戊巴比妥50 mg/kg麻醉，經L4、L5脊椎間隙將PE-10導管(20 cm)插入2 cm，經皮下隧道至頸部導出后于皮膚后方固定，采用熱熔風封口。鞘內置管成功后，參照文獻[5]方法進行SNL模型制備，大鼠麻醉后分離脊柱組織，暴露左側L4、L5橫突，將部分L5橫突去除，暴露L4～L5脊神經，采用非吸收外科線結扎L5脊神經并在遠端切斷。將大鼠隨機分為假手術組、Cont-shRNA組、SIRT1-shRNA組，每組18只。將陰性對照序列Cont-shRNA與SIRT1-shRNA序列克隆至腺病毒載體中，分別獲得含Cont-shRNA、SIRT1-shRNA的腺病毒載體。假手術組僅暴露脊神經不進行結扎處理，經鞘內注射25 μL生理鹽水，每天注射1次，連續7 d；Cont-shRNA、SIRT1-shRNA組模型制備成功后鞘內分別注射25 μL的Cont-shRNA、SIRT1-shRNA，均每天注射1次，連續7 d。

1.3 大鼠行為學測定 于第1、3、7 天時，各組分別取大鼠6只，置于玻璃箱用Von-Frey 纖維絲刺激足中底部至大鼠出現縮足或舔足反應，連續測量3次，記錄大鼠機械刺激縮足反應閾值(PWT)，取平均值。將大鼠置于熱輻射痛閾檢測儀，加大電源輻射刺激大鼠足底部，當出現縮足或舔足反應，連續測量3次，間隔時間5 min，記錄開啟電源至出現熱刺激縮足反應潛伏期所用時間(PTWL)。大鼠行為學測定后，麻醉放血處死，收集血液及脊髓腰膨大組織，置于-80 ℃中保存。

1.4 脊髓組織中SIRT1蛋白、Ac-H3蛋白表達檢測 采用免疫印跡法。取出冷凍脊髓組織研磨后用裂解液裂解、提取總蛋白，檢測蛋白濃度后，SDS-PAGE電泳分離等量蛋白，轉膜反應、封閉后，添加一抗(1∶500)4 ℃過夜，添加二抗(1∶5 000)室溫放置1 h，ECL顯色后凝膠成像儀中觀察并計算蛋白表達。

1.5 脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達檢測 采用ELISA法。用酶聯免疫吸附法檢測脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達，嚴格參照試劑盒說明操作。稱取0.1 g脊髓組織，加生理鹽水0.9 mL，置于勻漿器中制備組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，保存上清。設置空白孔(僅添加顯色溶液、終止液)、樣品孔，樣品孔中添加100 μL組織勻漿上清，室溫下封板孵育2 h，洗滌、拍干后添加100 μL生物素化抗體，洗滌、拍干后添加100 μL HPR反應液，室溫下封板后避光孵育20 min，洗滌、拍干后，添加顯色劑避光孵育15～20 min，添加50 μL終止液結束反應，450 nm波長處測定吸光度值，繪制標準曲線計算樣品濃度。

1.6 脊髓背角星形膠質細胞活化情況觀察 采用免疫熒光染色法。制備脊髓組織冷凍切片，加入TritonX-100放置30 min，山羊血清封閉37 ℃孵育1 h，添加GFAP一抗4 ℃中孵育過夜，加入FITC標記二抗37 ℃孵育1 h，置于熒光顯微鏡下觀察蛋白熒光強度，同時統計星形膠質數目。

1.7 脊髓神經元超微結構觀察 脊髓組織切片于3%戊二醛中固定，再次置于1%鋨酸內固定、乙醇中水合，包埋后行醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后置于透射電子顯微鏡下觀察神經元超微結構變化。

1.8 脊髓組織中凋亡蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3 表達檢測 采用免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3 蛋白表達。將脊髓組織研磨后添加裂解液裂解，提取脊髓組織總蛋白，BCA法測定蛋白含量后，SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜，添加山羊血清封閉，添加一抗(1∶500)4 ℃過夜，添加二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，ECL發光顯影后凝膠成像儀中觀察并計算蛋白表達。

2 結果

2.1 三組不同時點脊髓組織中SIRT1蛋白、Ac-H3蛋白表達比較 見表1、2。

表1 三組不同時點脊髓組織中SIRT1蛋白表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

表2 三組不同時點脊髓組織中Ac-H3蛋白表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

2.2 三組不同時點PWT、PTWL比較 見表3、4。

表3 三組不同時點PWT比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

表4 三組不同時點PTWL比較

注：與假手術組相比，*P<0.05。

2.3 三組脊髓背角星形膠質細胞活化情況 假手術組脊髓背角GFAP蛋白正常表達，熒光較弱，胞體不明顯；干預第1 天，Cont-shRNA組GFAP蛋白熒光亮度增強，第3、7 天星形膠質細胞體積增大；與Cont-shRNA組相比， SIRT1-shRNA組GFAP蛋白熒光亮度減弱，星形膠質細胞體積變小。三組不同時點脊髓背角GFAP陽性細胞數比較見表5。

表5 三組不同時點脊髓背角GFAP陽性細胞數比較(個，

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

2.4 三組脊髓背角GFAP蛋白表達比較 見表6。

表6 三組脊髓背角GFAP蛋白表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

2.5 三組不同時點脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達比較 見表7～9。

表7 三組不同時點脊髓組織中TNF-α表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

表8 三組不同時點脊髓組織中IL-1β表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

表9 三組不同時點脊髓組織中IL-6表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

2.6 電鏡下脊髓背角神經元結構變化 假手術組第1、3、7 天神經元細胞核表面光滑呈現圓形，細胞核中染色質明顯，細胞質內核糖體、線粒體等形態正常，均勻分布。Cont-shRNA組第1 天神經元腫脹，線粒體、內質網等腫脹裂解，第3、7 天時神經元出現皺縮、變形，細胞核固縮，染色質濃縮貼于核膜邊，呈現凋亡狀。SIRT1-shRNA組第3 天，神經元異形程度明顯減輕，染色質縮短程度以及核膜邊集程度減輕。見圖1。

圖1 電鏡觀察脊髓背角神經元超微結構(10 000×)

2.7 三組不同時點脊髓背角組織中凋亡相關蛋白表達比較 見表10。

表10 三組不同時點脊髓背角組織中凋亡相關蛋白表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與Cont-shRNA組相比，#P<0.05。

3 討論

組蛋白乙酰化屬于表觀遺傳學研究重要內容，組蛋白發生乙酰化時，可抑制或促進基因轉錄，進而在腫瘤、應激、創傷等病理過程中發揮調控作用。SIRT1屬于組蛋白去乙酰化酶，通過對底物進行去乙酰化調控，參與細胞增殖、凋亡、周期調控等生理過程。在人胚腎細胞中發現，SIRT1通過抑制啟動子Bclaf1激活進而抑制T細胞活化，此作用通過介導組蛋白56位賴氨酸去乙酰化作用實現[6]。在急性腎缺血再灌注模型中研究發現，髓質外層中SIRT1表達明顯增加，此與組蛋白去乙酰化水平下降密切相關[7]。近期研究發現，乙酰化平衡狀態的破壞與神經病理性疼痛密切相關,采用去乙酰化抑制劑治療腫瘤患者，疼痛增強，而停止治療則可減輕疼痛，表明去乙酰化抑制劑的使用與患者疼痛增強密切相關[8]。Shao等[9]研究發現，激活脊髓SIRT1后可緩解減輕小鼠神經病理性疼痛。王依慰等[10]發現，白藜蘆醇可通過激活SIRT1,促進p65去乙酰化緩解神經病理性疼痛。然而SIRT1去乙酰化是否影響SNL大鼠病理性疼痛，目前尚不明確。

本研究結果發現，與假手術組相比，干預第 1、3、7天， Cont-shRNA組SIRT1蛋白表達降低，差異有統計學意義，而與Cont-shRNA組相比，SIRT1-shRNA組SIRT1蛋白表達升高，差異有統計學意義，表明SIRT1序列成功在小鼠脊髓組織中高表達。進一步研究分析Cont-shRNA組大鼠行為學指標PWT、PTWL降低，SIRT1-shRNA組PWT、PTWL升高，表明上調SIRT1表達后能緩解大鼠病理性疼痛。進一步對組蛋白檢測發現上調SIRT1表達可明顯降低Ac-H3表達，提示SIRT1可能通過調控組蛋白乙酰化水平參與神經病理性疼痛的發生發展。

研究表明，星形膠質細胞在神經信號傳遞中發揮重要作用，且星形膠質細胞的持續激活與神經病理性疼痛密切有關，阻斷細胞激活可一定程度上減輕病理性疼痛[11,12]。GFAP為星形膠質細胞激活標志物[13]。本研究免疫熒光結果顯示，與假手術組相比，Cont-shRNA組脊髓背角星形膠質細胞體積增大，熒光亮度增強，且GFAP陽性細胞數隨處理時間的延長逐漸增多，而SIRT1-shRNA組星形膠質細胞體積增加不明顯，熒光強度減弱，且GFAP陽性細胞數減少，表明過表達SIRT1可抑制星形膠質細胞活化，降低其標志物的表達，過表達SIRT1可能通過抑制星形膠質細胞的活化進而緩解神經病理性疼痛。

胡傳銀等[14]研究顯示，L5SNL神經疼痛模型中脊髓膠質細胞內MAPK信號通路激活后可刺激下游炎癥因子活化如TNF-α、IL-1β、IL-6，作用于脊髓后角神經元，繼續加重神經病理性疼痛。研究顯示，大鼠神經病理性疼痛模型中膠質細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表達升高，采用TNF-α抑制劑預處理后則大鼠疼痛行為得到明顯緩解[18]。本研究結果顯示，Cont-shRNA組脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達明顯升高，而SIRT1-shRNA組脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達明顯降低，提示過表達SIRT1可減輕大鼠神經病理性疼痛，此可能與抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表達有關。

趙偉等[16]研究發現，SNL動物模型中存在神經元凋亡，導致γ -氨基丁酸減少，加速神經興奮，參與神經病理性疼痛的發生發展，采用Caspase抑制劑處理后可顯著抑制神經元凋亡，減輕病理性疼痛。此外，有研究還發現坐骨神經結扎大鼠給予Caspase抑制劑后可明顯緩解病理性疼痛，此可能與降低脊髓背角神經元凋亡、抑制神經生長因子有關[17]。本研究電鏡結果顯示，Cont-shRNA組神經元腫脹，線粒體、內質網等腫脹裂解，3、7 d時神經元出現皺縮、變形，細胞核固縮，染色質濃縮貼于核膜邊，呈現凋亡狀，SIRT1-shRNA組神經元異形程度明顯減輕，染色質縮短程度及核膜邊集程度減輕，提示過表達SIRT1可能抑制神經元凋亡。研究顯示,沉默SIRT1后可下調Bcl-2蛋白、上調Bax及cleaved-Caspase-3 蛋白表達，抑制BDNF對神經元的凋亡[18]。本研究結果顯示，與假手術組相比，干預后1、3、7 d Cont-shRNA組 Bcl-2蛋白表達降低，Bax、cleaved-Caspase-3 蛋白表達升高，SIRT1-shRNA組Bcl-2蛋白表達升高，Bax、cleaved-Caspase-3 蛋白表達降低，提示過表達SIRT1后可影響凋亡蛋白的表達進而影響神經元凋亡。

綜上所述，SNL大鼠過表達SIRT1后，通過抑制星形膠質細胞活化，降低神經元凋亡緩解SNL大鼠病理性疼痛，然而SNL神經病理性疼痛發生機制較復雜，SIRT1是否還可能通過影響其他途徑發揮作用，有待進一步深入探究。