苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解豆漿中大豆異黃酮的工藝研究

郭天賜，趙石磊，劉石生，*

（1.海南大學食品學院，海南 海口 570228；2.海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 海口 570228）

β-葡萄糖苷酶（β-D-glucoside，EC3.2.1.21）可以水解糖基原子與烴基或芳香基團結合的糖苷鍵生成葡萄糖和相應的配基，它屬于一種水解酶[1-2]，Liebig 和Wohler 在研究苦杏仁汁時，該酶才被第一次報道[3]。大豆異黃酮具有抑制癌癥[4-5]、抗氧化[6]、防止骨質疏松[7]、防治動脈硬化[8]、抵抗神經退化疾病[9]、防糖尿病[10]等保健作用，研究發現其生物學功能的發揮主要依靠游離型苷元形式[11]，β-葡萄糖苷酶可水解大豆異黃酮糖苷[12-17]成游離型苷元。姚軼俊等[18]、周熒等[19]研究了固定化β-葡萄糖苷酶在大豆異黃酮水解上的應用，發現其水解率得到明顯的提升。Hsieh M C 等[20]、W Fang 等[21]從不同霉菌中提取獲得β-葡萄糖苷酶，結果顯示來源于真菌的該酶對大豆異黃酮的水解具有很好的效果。大豆異黃酮在大豆中含量最高，而豆漿是大眾最常飲用、最受歡迎的大豆食品，因而本課題研究在豆漿中添加苦杏仁β-葡萄糖苷酶，對其中大豆異黃酮糖苷水解的影響，有利于豆漿營養價值的提升。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生苦杏仁：市售；東北大豆：海口市鵬泰興超市。

氯化鈉、石油醚（60～90）、十二水和磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酒石酸、乙酸鋅、氯化鎂、硝酸鋁、無水甲醇、磷酸、無水乙醇：海南擎峰試劑有限公司，均為分析純；乙腈（色譜純）：默克化工技術有限公司。

對硝基苯-β-D-葡萄糖苷（4’-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，pNPG，質量分數≥99%）、考馬斯亮藍R-250、大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、大豆苷元、染料木素、黃豆黃素：上海源葉生物科技有限公司，均為生化試劑。

1.2 儀器與設備

XL-130B 粉碎機、IKA；HH-S26S 電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；FSH-Ⅱ型勻漿器：江蘇金壇市環宇科學儀器廠；TG16G 離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；BS124S 電子天平：德國Sartorius 公司；PHS-3C pH 計：上海雷磁儀器廠；7230G 可見分光光度計：上海精科實業有限公；XO-5200TDT 超聲波清洗機：南京先歐儀器制造有限公司；1-14 小型臺式離心機：Sigma 公司；安捷倫1260 液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜測定條件

色譜柱：Agilent TC-C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；保護柱芯：ZORBAX Eclipse Plus，12.5 mm×4.6 mm，5 μm；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A（pH 3 的磷酸水溶液）、B（乙腈）；后運行時間：5 min；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The condition of gradient elutiom

1.3.2 大豆異黃酮標準曲線的建立

精確稱取大豆苷（D）、大豆苷元（De）、黃豆黃苷（Gl）、黃豆黃素（Gle）、染料木苷（G）、染料木素（Ge）標樣各5.0 mg，加入80%的甲醇溶液，超聲溶解，定容至刻度，即為標準儲備液。精準吸取不同體積的標準儲備液，配制成不同濃度的混合標樣溶液，用0.45 μm 有機系的濾膜過濾，濾液裝入進樣品瓶中，高效液相色譜 （high performance liquid chromatography，HPLC）分析，測定各組分的峰面積。以大豆異黃酮各組分的峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標，進行回歸分析，計算大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素標準曲線。

大豆異黃酮含量的計算：

樣品濃度=（樣品峰面積/標樣峰面積）×標樣濃度×稀釋倍數

1.3.3 豆漿的制備方法

準確稱取東北大豆100 g，洗凈放入燒杯中，加入蒸餾水500 mL 于25 ℃條件下浸泡8 h～10 h，再用蒸餾水定量至1 000 mL，倒入豆漿機中制成豆漿（干濕模式），濾網過濾，冷卻后放入冰箱冷藏（4 ℃）待用。

1.3.4 苦杏仁β-葡萄糖苷酶酶液的制備方法

參考王佩環[22]的方法，稱取一定量苦杏仁，粉碎，與丙酮按料液比 1 ∶3（g/mL）脫脂，抽濾，待丙酮揮干，加水[料液比 1 ∶5（g/mL）]復溶，高速勻漿后離心過濾，加與濾液等量的丙酮再次沉淀，離心后棄去上清液，待丙酮揮干，將沉淀重新用蒸餾水溶解，勻漿，即為所需酶液，于冰箱4 ℃冷藏保存。

1.3.5 測定β-葡萄糖苷酶酶活性方法

參考李斐然等[23]的方法，對β-葡萄糖苷酶的活力進行測定。

測得標準曲線為：Y=17.071X-0.000 9，R2=0.999 8。

酶活/（U/mL）=0.5x/（30×0.1）×C，C 為稀釋倍數。

1.3.6 樣品的制備

于25 mL 具塞試管中加入5 mL 豆漿，再加入適量稀釋后的β-葡萄糖苷酶液，在水浴鍋中（不同溫度）反應一段時間后沸水浴5 min，冷卻至25 ℃，得到反應液。于10 mL 容量瓶中加入2 mL 反應液和80%甲醇溶液，50 ℃超聲30 min 后冷卻至25 ℃，用80%甲醇溶液定容，得到樣品溶液。將樣品溶液置于2 mL 離心管中，12 000 r/min 離心15 min，吸取上清液過0.45 μm的有機濾膜，濾液收集于進樣小瓶中，4 ℃冷藏待用。

1.3.7 苦杏仁β-葡萄糖苷酶對大豆異黃酮糖苷的水解試驗

將苦杏仁β-葡萄糖苷酶液和豆漿于一定條件下反應，通過調節加酶量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）以獲得更多的大豆苷元（De）、黃豆黃素（Gle）、染料木素（Ge）。

1.3.7.1 單因素試驗設計

以大豆苷（D）、大豆苷元（De）、黃豆黃苷（Gl）、黃豆黃素（Gle）、染料木苷（G）、染料木素（Ge）為指標，設計單因素試驗為：加酶量（0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 U/5 mL）、酶解時間（0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 h）、酶解溫度（30、35、45、55、65、75 ℃）

1.3.7.2 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以大豆苷元（De）、黃豆黃素（Gle）、染料木素（Ge）含量為響應值，設計三因素三水平的響應面優化試驗，各因素水平見設計表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 The factors and levels of response surface analysis

1.3.8 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 大豆異黃酮各組分標準曲線的建立

以大豆異黃酮的濃度為橫坐標，HPLC所測峰面積的平均值為縱坐標，以峰面積Y 與質量濃度X（μg/mL）進行回歸分析，得到線性方程。回歸方程見表3。

表3 6 種大豆異黃酮標準品的標準曲線Table 3 Standard curve of six soy isoflavone standards

2.2 大豆異黃酮色譜圖

對6 種大豆異黃酮的混標進行色譜分析，根據單標的保留時間確定依次出峰為大豆苷（D）、黃豆黃苷（Gl）、染料木苷（G）、大豆苷元（De）、黃豆黃素（Gle）、染料木素（Ge），對應出峰時間分別是 13.844、14.618、20.350、32.293、33.616、43.319 min。

圖1 6 種大豆異黃酮混合標準品色譜圖Fig.1 The chromatograms of six soy isoflavone in standards substance

2.3 苦杏仁β-葡萄糖苷酶對大豆異黃酮糖苷水解影響

2.3.1 加酶量對大豆異黃酮水解的影響

控制酶解溫度為45 ℃，酶解時間為0.5 h，改變加酶量，HPLC 檢測大豆異黃酮各組分的含量變化，結果見圖2。

圖2 加酶量對大豆異黃酮糖苷水解的影響Fig.2 The effect of enzyme addition on soybean isoflavone hydrolysis

隨著加酶量的上升，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量急劇下降，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量呈上升趨勢。當加酶量超過1 U/5 mL 時，隨著酶量的增加，大豆異黃酮各組分呈現穩定的趨勢。這是因為剛加酶時，大豆異黃酮糖苷底物濃度高，大大超過酶的濃度，酶的濃度與反應速度呈量效關系，當酶的濃度增加時，酶水解速度加快，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量迅速下降，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量逐漸升高，此時影響大豆異黃酮各組分含量的決定因素是酶的加入量。隨著酶量的增加，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的濃度增高，此時影響各組分含量的決定性因素是底物含量，此時再增加酶的用量對大豆異黃酮糖苷的水解影響不大。為了降低生產成本，并得到理想的處理效果，優選加酶量為1 U/5 mL。

2.3.2 酶解時間對大豆異黃酮水解的影響

控制加酶量為1 U/5 mL，酶解溫度為45 ℃，改變酶解時間，HPLC 檢測大豆異黃酮各組分的含量變化，結果見圖3。

圖3 時間對大豆異黃酮糖苷水解的影響Fig.3 The effect of time on soybean isoflavone hydrolysis

隨著反應時間的增加，大豆異黃酮苷（D、G、Gl）呈現下降的趨勢，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量不斷增加。當酶解時間超過0.5 h 時，隨著時間的增加，所測6 種大豆異黃酮的含量變化趨于穩定狀態。因為反應剛開始時，苦杏仁β-葡萄糖苷酶與底物作用的時間太短，不能有效的將糖苷型大豆異黃酮水解。隨著酶與底物接觸時間的增加，可以看出大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量逐漸降低，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量逐漸增加。當酶解到達一定程度時，受到大豆異黃酮產物濃度的抑制作用，水解反應達到平衡，大豆異黃酮各組分的含量不再變化。因此選擇酶解時間為0.5 h。

2.3.3 酶解溫度對大豆異黃酮水解的影響

控制加酶量為1 U/5 mL，酶解時間為0.5 h，改變酶解溫度，HPLC 檢測大豆異黃酮各組分的含量變化，結果見圖4。

圖4 溫度對大豆異黃酮糖苷水解的影響Fig.4 The effect of temperature on soybean isoflavone hydrolysis

溫度低于 45 ℃時，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量隨著溫度的升高呈現下降的趨勢，而大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量則隨溫度的升高不斷升上。當溫度超過 45 ℃時，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量與溫度呈現正相關的關系，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量隨溫度升高含量逐漸下降。這是因為在溫度較低時，溫度對分子碰撞概率的影響比較大，溫度升高可以加快分子運動速率，提高分子碰撞概率，酶與底物的碰撞概率增加，從而使反應速率加快。當溫度高于45 ℃時，酶的部分蛋白質開始變形，空間結構發生變化，溫度升高對酶蛋白的變形作用更加嚴重，導致酶的活力下降，酶水解的反應速率下降，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量會逐漸增加，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量逐漸下降。因此選擇最佳溫度為45 ℃。

2.3.4 苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的響應面試驗

根據Box-Behnken 中心設計原理，以苦杏仁β-葡萄糖苷酶的加酶量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）作為響應因素，以大豆異黃酮苷元（De、Gle、Ge）濃度作為響應值進行試驗，試驗結果見表4。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 The response surface design and experimental result

利用Design-expert 7.0.0 軟件對數據進行回歸分析，得到各因素與大豆苷元（De）濃度Y1回歸方程為：

Y1=37.31+2.38A+2.38B+0.18C-0.042AB+0.065AC-0.043BC-2.8A2-1.72B2-4.17C2。De 回歸模型方差分析見表5。

表5 De 回歸模型方差分析表Table 5 The variance analysis of regression model of De

由表5所示可知，方程模型是極顯著的（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.521 5＞0.05），說明該模型擬合良好，可以用于分析和預測苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解大豆苷（D）的試驗條件。該模型一次項中的A、B，二次項中的A2、B2、C2對苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解有極顯著的影響，二次項中的AB、BC、AC 交互作用對苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解的影響不顯著，一次項中C 對水解反應的影響顯著，模型的相關系數R2=0.976 1，說明試驗誤差較小。而R2Adj=0.945 3，說明可信度較高。通過結果可以看出，本試驗中3 個因素影響大豆苷元（De）濃度的次序為B＞A＞C。

利用Design-expert 7.0.0 軟件對數據進行回歸分析，得到各因素與黃豆黃素（Gle）濃度Y2回歸方程為：

Y2=5.57+0.8A+0.86B+0.22C-0.034AB-0.36AC+2.25×10-3BC-0.69A2-0.49B2-1.25C2。Gle 回歸模型方差分析見表6。

表6 Gle 回歸模型方差分析表Table 6 The variance analysis of regression model of Gle

由表6所示可知，在失擬項不顯著的前提下，得到的回歸方程極其顯著。該結果表明，采用軟件模擬的方程模型是理想的。所得的相關系數R2=0.976 3，說明方程預測的結果與試驗結果擬合性較好，而R2Adj=0.945 7，說明可信度高。響應面回歸模型中A、B、A2、B2、C2（P＜0.01）對苦杏仁β-葡萄糖苷酶酶解反應的影響極顯著，C、AC 對苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解的影響顯著。AB、BC（P＞0.05）交互因素項對黃豆黃素（Gle）的濃度的影響不顯著。通過結果可以看出，本試驗中3個因素影響黃豆黃素（Gle）濃度的次序為B＞A＞C。

利用Design-expert 7.0.0 軟件對數據進行回歸分析，得到各因素與染料木素（Ge）濃度Y3回歸方程為：

Y3=41.74+6.38A+4.84B+1.35C-0.41AB-0.55AC+2BC-3.65A2-4.85B2-6.97C2。Ge 回歸模型方差分析見表7。

表7 Ge 回歸模型方差分析表Table 7 The variance analysis of regression model of Ge

由表7所示可知，在失擬項不顯著的前提下，得到的回歸方程極其顯著。結果表明，采用軟件模擬的方程模型是理想的。所得的相關系數R2=0.979 3，說明了方程預測的結果與試驗結果擬合性較好。而R2Adj=0.952 6，說明可信度高。從各因素A、B、C 對染料木素（Ge）濃度的影響來看，A、B、A2、B2、C2的影響均為極其顯著（P＜0.01），BC 的交互作用對 Ge 的濃度影響顯著（P＜0.05）。而 C 與 AB、AC 的交互作用對染料木素（Ge）的濃度影響不顯著。通過方程結果可以看出，試驗中3 因素的影響穩定性系數值得次序為：A＞B＞C；由方程及方差分析結果可看出各因素與染料木素（Ge）濃度之間的關系呈二次關系。

優化3 個影響因素的最佳組合為：加酶量為1.28 U/5 mL，酶解時間0.66 h，酶解溫度為45.6 ℃，預測大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的濃度分別為38.561、6.135、45.255 μg/mL。在試驗條件下：加酶量為1.4 U/5mL，反應時間40 min，反應溫度46.0 ℃，測得大豆異黃酮苷元（De、Gle、Ge）的濃度分別為（36.954±1.67）、（5.119±0.275）、（38.643±2.03）μg/mL，與模型預估值相差不大，說明軟件模擬出的模型是可信的。

3 結論

將苦杏仁β-葡萄糖苷酶添加到豆漿中進行反應，通過控制加酶量、酶解溫度和酶解時間進行單因素試驗。以單因素為基礎進行響應面優化試驗，得到3 個影響因素的最佳組合為：加酶量為1.4 U/5mL，反應時間40 min，反應溫度46.0 ℃，測得大豆異黃酮苷元（De、Gle、Ge） 的濃度分別為（36.954±1.67）、（5.119±0.275）、（38.643±2.03）μg/mL。

已有研究分別從大豆、鷹嘴豆、黃熱厭氧芽孢桿菌、土曲霉等[15，24-25]中提取β-葡萄糖苷酶，用以水解大豆異黃酮糖苷，并進一步將其進行固定化，結果顯示微生物來源的β-葡萄糖苷酶比植物來源的熱穩定性更強，最適水解溫度更加寬泛，水解效果更好，且固定化β-葡萄糖苷酶相比之下提高了利用重復率，反應過程更易控制。目前研究最廣泛水解大豆異黃酮糖苷的酶是β-葡萄糖苷酶，其次是半乳糖苷酶[26]，少數有機酸[27-28]也能水解大豆異黃酮，更多水解大豆異黃酮的方法有待進一步研究。