薏苡附子敗醬散抗肝癌作用的實驗研究*

孫 燕 ，張露蓉 ，2△，姚 霏 ，2，陳 江

（1.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州 2150092.蘇州市吳門醫派研究院，江蘇 蘇州 215009）

肝癌是中國常見的消化道惡性腫瘤之一，病死率在腫瘤中居第2位[1]。由于肝癌的惡性程度及侵襲性高，多數患者確診時已經為中晚期[2]，使得治療形勢不容樂觀[3-5]。中醫認為，陽氣虧虛、濕熱聚毒、氣滯血瘀等是肝癌發生的病理基礎[6]，具有寒、濕熱、瘀等特點。中醫藥治療寒、濕、瘀之病癥，注重辨證施治、扶正驅邪、調理氣機，以達到補陽散寒、祛濕化瘀解毒的功效[7]。

薏苡附子敗醬散在《金匱要略·瘡癰腸癰浸淫病脈證并治》中有所記載，方中包括薏苡仁、附子、敗醬草3味藥，具有破瘀散結，溫補陽氣的功效[8-10]，常用于由寒、濕、瘀所致的多種疾病的治療[11-14]。這與肝癌的發病機理所對癥。此外，有文獻報道君藥薏苡仁中的有效成分薏苡仁油可以抑殺肝癌細胞，并已制成康萊特注射液供臨床上使用[15]；附子提取物對移植性肝癌H22細胞的生長具有抑制作用[16]；黃花敗醬總皂苷、總黃酮類亦對腫瘤有一定的抑制作用[17]?？梢?，從中醫病因和單味藥角度，薏苡附子敗醬散可拓展應用于肝癌的治療。臨床上，對肝癌的治療雖未見報道，但應用此方加味聯合化療治療大腸癌頗有成效[18]。因此，本文圍繞薏苡附子敗醬散，探討其抗肝癌的效應及有可能的作用機理，為該方臨床用于抗肝癌提供實驗依據，亦為臨床合理使用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 儀器基礎電泳儀電源（北京百晶生物技術有限公司）；酶標儀（Molecular Devices公司）；FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；凝膠成像分析系統（美國ProteinSimple公司）。

試劑 DMEM培養液（GIBCO公司，批號：1993895）；胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司，批號：18120503）；胰蛋白酶（閃晶生物公司，批號：2594141）；二甲亞砜（天津DAMAO化學試劑廠，批號：20150906）；順鉑（齊魯制藥有限公司，批號：AA1A8028B）；四甲基偶氮唑鹽（BioFROXX公司，批號：EZ2811A179）；Annexin V-PE 細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司，批號：20180518）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0010）；ECL檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180228）；β-actin（CMCTAG 公司，批號：1832NJ）；Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體（Cell Signaling公司，批號分別為：0012，0037，0005，0005）。

藥材 薏苡仁（批號產地：190306河北）；附片（黑順片）（批號產地：190306四川）；敗醬草（批號產地：190306河北）。購自于蘇州市春輝堂藥業有限公司。

細胞株及動物 小鼠肝癌細胞株Hepa1-6由蘇州大學生命科學院饋贈。SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量18～22 g，購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，動物生產許可證號：SCXK（JING）2014-0004。

1.2 藥液制備 按經方比例稱取薏苡仁30 g，附子6 g，敗醬草15 g，按照 8倍量純水冷浸30 min，回流提取1 h，傾出藥液；藥渣再按6倍量加入純水，回流提取30 min，傾出藥液。將兩次藥液進行減壓濃縮，最終至生藥含量1 g/mL，冷藏備用。

1.3 荷瘤小鼠模型建立及給藥 參照實驗室建立的方法制備荷瘤小鼠模型[19]：用 PBS把Hepa1-6肝癌細胞密度調整為1×107個/mL，然后取0.2 mL的細胞懸液接種于C57 BL/6小鼠的腋下，建立模型。種瘤8～10 d之后觀察成瘤情況。將成瘤小鼠分為模型組、順鉑陽性藥物組（5 mg/kg），薏苡附子敗醬散低、高劑量組（7.735、15.47 g/kg），每組6只小鼠。灌胃給藥，持續14 d，每天1次，最后1次給藥12 h后，處死小鼠，測定瘤重。抑瘤率 =［1-（給藥組瘤重/對照組瘤重）］×100%。

1.4 細胞培養 Hepa1-6肝癌細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM（pH 7.0）完全培養基，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，每24 h更換1次培養液，待細胞生長至對數生長期時，用0.25%胰酶進行消化、傳代，取第3～4代對數生長期的Hepa1-6細胞用于實驗。

1.5 MTT檢測細胞活力 將對數生長期的Hepa1-6細胞，接種于96孔板。分別加入不同生藥濃度（10、20、30、40、50 mg/mL）的薏苡附子敗醬散藥液并作用24、48、72 h。以不加藥物為空白組，順鉑（50 μg/mL）為陽性藥物組。加入MTT后培養4 h，棄去上清，加入DMSO，在酶標儀490 nm得到吸光度OD（λ）值。細胞增殖抑制率=［（1-給藥組OD值/對照組OD值）］×100%。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 將Hepa1-6肝癌細胞接種于6孔板，給藥組分別加入不同生藥濃度的薏苡附子敗醬散（10、20、30、40、50 mg/mL），空白組不加藥，培養48 h后分別加入Annexin V和FITC進行染色，流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot檢測 取對數生長期的Hepa1-6肝癌細胞，接種于6孔板。給藥組分別加入30、40、50 mg/mL生藥濃度的薏苡附子敗醬散，空白組不加入藥物，培養48 h。裂解，離心，提取蛋白，用BCA法定量；SDS-PAGE電泳；PVDF膜轉膜，封閉；一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST漂洗，二抗（1∶1 000）室溫孵育 1 h，TBST漂洗；ECL 曝光、顯影。以β-actin為內參，計算蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 薏苡附子敗醬散體內外對Hepa1-6細胞的抗肝癌效應 觀察薏苡附子敗醬散在體內抗腫瘤作用時發現，與模型對照組瘤重（1.83±0.72）g相比，7.735、15.47 g/kg薏苡附子敗醬散組瘤重分別為（1.21±0.33）g 和 （0.79±0.33）g，抑瘤率分別為 （33.78±17.85）%、（56.95±18.17）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨著薏苡附子敗醬散劑量的增加，瘤重減小，抑瘤率增大，表明薏苡附子敗醬散對Hepa1-6荷瘤小鼠腫瘤的生長具有抑制作用，見圖1A、1B。

從體外對Hepa1-6肝癌細胞增殖抑制的實驗中發現，隨著給藥濃度以及作用時間的增加，抑制率增加，并呈一定的劑量-時間依賴關系，見圖1C。以上結果表明薏苡附子敗醬散體內外均具有抗肝癌效應。

圖1 薏苡附子敗醬散體內外對Hepa1-6細胞的抗肝癌效應

2.2 薏苡附子敗醬散對Hepa1-6細胞凋亡的影響 為了探究薏苡附子敗醬散的抗肝癌機理，檢測了對Hepa1-6細胞凋亡的影響。結果顯示，與空白對照組相比，隨著薏苡附子敗醬散濃度的增加，凋亡率逐漸上升，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明薏苡附子敗醬散可促進Hepa1-6細胞凋亡，并有劑量依賴性，見圖2。

圖2 薏苡附子敗醬散對Hepa1-6細胞凋亡的影響

2.3 薏苡附子敗醬散對Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 由于薏苡附子敗醬散對Heap1-6細胞具有促凋亡作用，因此隨后檢測了凋亡相關蛋白的表達情況。發現與空白組相比，隨著薏苡附子敗醬散濃度的增加，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3 表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降（見圖3A、3B），Bax/Bcl-2值上升（見圖3C），差異具有統計學意義（P＜0.05）。說明薏苡附子敗醬散通過調控凋亡相關蛋白的表達來促進肝癌細胞凋亡，見圖3。

圖3 薏苡附子敗醬散對Hepa1-6細胞中凋亡蛋白表達的影響

3 討論

肝癌在中醫藥史上屬于“癥瘕”“脅肋脹痛”等范疇[20]，歷代醫家對其有一定的記錄，如“肝脈微急為肥氣，在脅下”“伏梁，環臍而痛”等[21]，并認為肝癌是由正虛邪實、內外交爭引起的，陽氣不足、瘀毒濕熱是形成肝癌的病因[22-23]。薏苡附子敗醬散中薏苡仁和敗醬草化濕消腫散結、瀉火解毒化瘀，再加上附子性熱味辛、助陽祛寒，通達經絡，行郁滯之氣，增強薏苡仁和敗醬草的滲濕、除瘀、散結之功，共達散寒助陽、化瘀祛濕之效[24]?，F代藥理學研究發現，該方有消炎止痛、抑制腫瘤生長的功效[24-25]，并且方中3味單藥均有抗肝癌效應[15-17]，提示薏苡附子敗醬散在抗肝癌方面有應用潛能。因此，在應用C57 BL/6荷瘤小鼠模型評價該方的體內抗肝癌效應時，發現該方可以降低荷瘤小鼠的瘤重，抑制腫瘤生長。通過體外細胞實驗表明，該方能夠抑制Hepa1-6細胞增殖，體現出一定的肝癌抑制效應。綜上結果，表明該方對肝癌的生長具有抑制作用。

誘導腫瘤細胞凋亡是抗肝癌機制之一[26-27]。研究表明，肝癌細胞在體內外因素的影響下，經過相關信號轉導通路的調控，使細胞發生特性改變從而誘導凋亡[28]。從流式細胞術結果中發現，薏苡附子敗醬散可誘導肝癌細胞凋亡，說明該方通過促進細胞凋亡來抑制增殖。Bcl-2家族中Bcl-2和Bax分別為抑制和促進凋亡的兩個核心蛋白[29]，Bax/Bcl-2值是判斷線粒體外膜通道穩定與否和細胞凋亡發生與否的重要評判標準[30]。Caspases家族有10個成員，分為凋亡起始者和執行者[31]。其中Caspase-3具有抑制劑特異性，降解PARP、DFF-45，抑制DNA的修復并啟動DNA的降解，參與細胞凋亡的執行[32]；而Caspase-3活化產生的cleaved Caspase-3，其表達程度可反映Caspase-3的活性和細胞凋亡情況[33]。進一步研究其促凋亡作用機制，發現薏苡附子敗醬散組可使Bax表達升高，Bcl-2表達下降，Bax/Bcl-2值上升，同時可調控Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表達，且有劑量依賴效應。綜上表明，薏苡附子敗醬散可能通過調控線粒體凋亡途徑誘導Hepa1-6肝癌細胞發生凋亡。

本研究結果顯示，薏苡附子敗醬散動物體內能抑制腫瘤生長，體外能抑制Hepa1-6細胞增殖，并且誘導肝癌細胞凋亡。其機制可能與調控Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3等凋亡相關蛋白表達相關。本研究為薏苡附子敗醬散抗肝癌的臨床應用提供了實驗依據，但是，薏苡附子敗醬散抗肝癌具體機制和特點尚未完全闡明，另外，給藥途徑為口服的中藥復方，本文只用水提液進行體外細胞試驗，對于評價其臨床活性還有所欠缺。因此薏苡附子敗醬散抗Hepa1-6肝癌細胞生長作用未來能否轉化為臨床用于肝癌的治療還需要進一步研究。